碳酸酐酶的应用

碳酸酐酶的应用

碳酸酶（ca，ec4.2.1）是一种含有zn2的金属酶，能有效地激活co2的逆水合反应。反应方法如下。CO2水合这一可逆反应在没有催化剂催化的情况下,反应是非常缓慢的(动力学在15s的范围)。碳酸酐酶是反应速率最快的酶之一,它的速率主要受其底物的扩散速率限制。不同类型的碳酸酐酶的典型催化速率为104~106/s。1933年Meldrum和Roughton首次从牛红细胞中发现碳酸酐酶,后来的研究证明了所有哺乳动物的组织和细胞类型中均含有碳酸酐酶,且碳酸酐酶也广泛存在于单细胞绿藻与植物中。根据氨基酸序列的不同,碳酸酐酶主要分为α、β、γ、δ、ε五种不同类型。其中α-CA存在于脊椎动物、细菌、藻类及绿色植物的胞浆中;β-CA存在于高等植物及藻类叶绿体中,对植物光合作用过程中CO2的获取以及CO2浓度的维持有着必不可少的作用;γ-CA则主要存在于太古细菌等一些细菌中;δ-CA主要存在于海洋硅藻中;ε-CA是近年来才确定的类型,主要存在于蓝细菌及一些化能自养型细菌中。多年来人们对碳酸酐酶的研究主要集中在与人类关系密切的α-CA和β-CA上。α-CA在氨基酸序列上存在20%~60%的同源性,哺乳动物几乎所有组织中都含有参与机体多种生命活动的α-CA。碳酸酐酶已被应用于许多领域,比如生物检测、天然活性物质的筛选、生物传感器、CO2捕集和生理诊断等方面。对碳酸酐酶进行细致的酶学性质研究,离不开对其酶活的测定。碳酸酐酶的酶活测定方法有多种,但各自都有其局限性与缺点,至今也没有一种快速、可靠、简便且精确的酶活测定方法。笔者将对碳酸酐酶目前的应用现状进行综述,并且对几种碳酸酐酶酶活测定方法进行总结和优缺点分析。1碳酸铵酶的应用1.1碳酸酐酶检测污染物采用碳酸酐酶替代检测点,碳酸酐酶碳酸酐酶对水环境中的化学污染物,比如重金属离子和单价阴离子,有较高的敏感性,根据这一特点,碳酸酐酶可以用作环境污染快速检测的新方法。意大利科学家Lionetto和Caricato等采用摩尔剂量浓度的铜、汞和镉等重金属离子来抑制碳酸酐酶的酶活性,通过对地中海贻贝中碳酸酐酶的研究,发现1.785μmol/L的氯化镉就可以充分抑制地中海贻贝中碳酸酐酶的体外活性。1.2磺胺类化合物r的抑制剂研究碳酸酐酶与人体内的很多种生理代谢活动都有着密切的关联,因此它也是许多疾病的根源,比如青光眼、癫痫、神经障碍和骨质疏松症等。人们通过研究碳酸酐酶的抑制剂,从而开发出相关的治疗药物。早在60多年前,人们就已发现磺胺类药物结构中的(R)SO2NH2官能团对碳酸酐酶有极强的抑制作用。通过研究发现,改变(R)SO2NH2中的R基团结构,可以得到一系列磺胺类的碳酸酐酶抑制剂药物,比如抗青光眼替代药物、利尿剂、抗癫痫药物、调控高山病药物、治疗胃和十二指肠溃疡、神经障碍及骨质疏松药物等,目前已开发的药物主要有乙酰唑胺、醋甲唑胺、托吡酯和鞣花单宁等。中国科学院昆明植物研究所的谭宁华等人采用了ELISA法,在96孔酶标板上以碳酸酐酶I(CAII)作为靶点蛋白,筛选了五千多个天然动植物样品,通过对这五千多个样品的处理,他们随后又从中发现255个CAII的抑制剂,其中包括了224个提取物(或分离部位)和31个化合物。1.3生物传感器的应用生物传感器(biosensor)是一类特殊形式的传感器,是一种对生物物质敏感并将待测物质转换为声、光、电等信号进行检测的仪器。它是由固定化的生物敏感材料作识别元件(包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质),与适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。它具有速度快、成本低、专一性强、稳定性好、分析精度高、操作系统简单、容易实现自动分析等优点,因此在医疗保健、疾病诊断、食品检测、化工分析、发酵工业等领域有着广泛的应用。CO2气敏电极是生物传感器重要的内电极之一,以前使用的CO2气敏电极缺点较多,主要是反应速度慢和灵敏度低,尤其是受到测定温度的影响很大。江苏农学院的郭敏亮等人通过将碳酸酐酶固定于CO2气透膜上,制成的碳酸酐酶膜不但可以缩短电极响应时间,而且能够扩大以CO气敏电极作为内电极的这类生物传感器的线性范围。除此之外,这种膜的稳定性很高,在夏季室温下保存半年也没有明显的活性变化。氙核磁共振传感器在早期疾病的诊断中很有发展前景。美国宾夕法尼亚州罗切斯特大学的JenniferM.Chambers和P.AruHill等人用单一结合位点的碳酸酐酶作为识别元件,研究氙生物传感器和蛋白质之间的相互作用。X-射线的晶体学结果显示,在CAII的活性中心只含有一个氙原子,该生物传感器能使129氙的核磁共振线宽发生的偏移比之前大很多。此外,尽管CAI和CAI在结构上有相似性,但是同工酶之间的特异性化学位移却存在明显的差异。所以,氙生物传感器可以为人类疾病诊断提供一条有效的途径。1.4组合真空碳酸钙吸收法近年来由于碳酸酐酶的高效催化特性,它被广泛地应用于CO2的固定。当前碳酸酐酶应用于CO2捕集的技术主要分为:非固定化碳酸酐酶固定CO2、固定化碳酸酐酶固定CO2和碳酸酐酶膜生物反应器。2007年,美国UniversityofIllinoisatChampaignandUrbana(UIUC)的研究者们提出了一项新的热钾碱工艺,称为组合真空碳酸盐吸收法(IntegratedVacuumCarbonateAbsorptionProcess,简称IV-CAP)。这种方法以K2CO3作为吸收剂吸收CO2,同时也能去除SO2。IVCAP工艺吸收塔的温度为40~50℃;解吸塔的温度为50~70℃,该解吸塔可以利用来自电厂低压管道里低质量的废热气,为解吸过程提供能量,从而大大地减少了能量的损失。由于该工艺用到的溶液K2CO3是弱的CO2吸收剂,吸收速率慢,需要添加活化剂以加快吸收速率。于是该工艺的后续研究者们就提出了使用碳酸酐酶作为活化剂,即成为了IVCAP-CA工艺。吸收剂K2CO3溶液中,CA催化的总反应方程式为:ZhangYT等人将碳酸酐酶与膜分离技术结合,构建了一个碳酸酐酶渗透器,这个“渗透器”由薄膜分离开的两个中空的纤维孔膜组成。将碳酸酐酶固定在中空的纤维壁上,这样可以最大化地接触气液两相界面上的CO2,然后再通过促进液膜来吸收CO2并且迅速地转化成为NaHCO3,这种方法可以大大地增加CO2的吸收率和解吸率。2碳酸铵酶的酶活性测定目前碳酸酐酶的酶活检测方法主要有:(1)测压法;(2)比色法;(3)电极法;(4)酯酶测定法。2.1船型装置的酶活测定碳酸酐酶最早的酶活测定方法是测压法。测压法的原理是将底物NaHCO3加入到含有一定量酶的磷酸盐缓冲液中时,CO2会加速释放出来,用压力计测出因CO2释放的增加而产生的压力变化,并且用不同时间段内压力的变化来表征碳酸酐酶的活性。测压法中用到了一个船型的装置来进行反应。测压法的整个实验装置如图1,由一个压力计,一个船型容器和一个水槽组成。在进行酶活测定之前,在船型装置一边的隔间里放入2mL的磷酸盐溶液(由等体积的0.2mol/L的Na2HPO4和0.2mol/L的KH2PO4混合制成),同时在另一边的隔间里放入2mL的0.2mol/L的NaHCO3(由NaHCO3溶于0.02mol/L的NaOH溶液中制成)。船型装置的开口由塞子密闭,并由一根导管通过塞子连接到压力计上。整个装置置于一个恒温的水槽中。在常压下,将水槽内的水恒温到15℃后,迅速晃动船型装置,在CO2开始释放之后观察压力机的读数,记录下0、5、10、15、30、45、60、90、120秒时的数据,此后根据情况每隔1min记录一次。用R0表示未添加催化剂时的反应速率,用R表示加入催化剂后反应的速率,(R-R0)/R0即是一个表征酶活的值。但测压法的操作比较繁琐,而且由于CO2释放出后从液体中扩散到气体这个过程,使得测量的误差比较大。2.2酶活的测定t01946年,Roughton和Booth在利用测压法研究基质浓度、pH和其他一些因素对碳酸酐酶的酶活影响时,提出了一个相对更简单的测定方法———比色法。比色法的原理是根据指示剂在pH值上升或下降到某个值的时候,会因跃迁而立即变色,在实验过程中加入CO2饱和冰水溶液后,缓冲液体系的pH值下降,到达某个值后指示剂变色,并且立即记录这一过程的时间,以此来表征酶活。在实验前,先将3mL的巴比妥缓冲液(由0.022mol/L的巴比妥溶于0.22mol/L的钠盐中制得,pH=7.95),3滴溴百里酚蓝,和2.3mL的蒸馏水(或者是0.3mL的酶+2mL的蒸馏水)混合于15mL的称量瓶中,用塞子塞住并且置于冰上冰浴至少15min。开始实验时,将5mL的饱和CO2冰水溶液用长嘴玻璃注射器注入缓冲溶液中,这一过程要保持与空气隔绝,并且不能有冒泡或损失CO2。将含有溴百里酚蓝的pH值为6.3的巴比妥缓冲液的颜色,作为反应终点的参照颜色。记录实验组在加入CO2饱和冰水溶液后至颜色变化为终点参照颜色所用的时间。将不加酶的情况下的反应时间设为t0,加入酶时的反应时间设为t,用(t0-t)/t表示酶活。比色法较之于测压法来说,操作更为简单,而且误差也小。但由于指示剂对酶的活性存在着影响,因此测得的酶活不能完全反应真实的酶活,这也是比色法最大的缺陷。2.3电极法测碳酸酐酶酶活的实验由于测压法和比色法都不能满足对碳酸酐酶酶活的精确测量,因此1948年Wilbur和Anderson又提出了一种新的碳酸酐酶酶活测定方法。这个方法称为电极法,它的原理是利用pH计来测定反应溶液中在加入CO2饱和冰水溶液后pH值的变化,记录下pH变化一定范围所用的时间,用来表征碳酸酐酶的酶活。Wilbur和Anderson利用了一个装置来进行电极法测碳酸酐酶酶活的实验,见图2。该装置主要是采用了两个用量程的自动注射器,使得酶活测定更加方便快捷。整个电极法测碳酸酐酶酶活的实验过程都是在0℃冰浴下操作完成。实验时,在反应器R中加入1~2mL的蒸馏水或者含有酶液的蒸馏水;将制备好的CO2饱和冰水溶液和巴比妥缓冲液(pH=8.15)通过打开图2中的1、4阀门,注入到注射器中,然后关闭1、4阀门,打开2、3阀门,同时将一定量的CO2饱和冰水溶液和巴比妥缓冲液通过注射器注入到反应器R中,并将2、3阀门关闭,打开1、4阀门。记录下pH值从8降到6.3时所用的时间。将不加酶的情况下的反应时间设为t0,而加入酶时的反应时间设为t,(t0-t)/t即表示一个酶活单位。电极法较测压法和比色法的相比,其优点在于更加精确,且不易受到反应中缓冲液等试剂对酶活的影响。但电极法对于设备的要求较高,尤其是pH计的灵敏度与精确度,而且电极法测得的酶活的线性响应范围较小,不能够准确地测量酶活的微小差别。2.4酯酶活性测定在对碳酸酐酶进行深入研究的同时,人们发现了碳酸酐酶不仅可以催化CO2的水合反应,也能够催化氰酸盐水合来形成氨基甲酸,将乙醛水合生成宝石二醇,并且发现有的碳酸酐酶还具有酯酶活性,能用于催化磺酸酯、羧酸酯、磷酸酯等使之水解。1967年VerpoorteJA提出了一种测定碳酸酐酶酯酶活性的方法,通过酯酶活性来间接地表示碳酸酐酶的酶活性。碳酸酐酶的酯酶活性测定方法是一种间接的测定与表征碳酸酐酶酶活的方法,它的原理就是利用碳酸酐酶的酯酶活性来催化乙酸对硝基苯酯,通过测定一定反应时间前后的吸光度变化来得到酶活的数据。实验中所用的乙酰对硝基苯酯(p-NPA)是用丙酮或者乙腈作为溶剂新鲜制备。实验时,将新鲜制备的1mL的3的p-NPA加入到1.9mL的100mmol/L的磷酸缓冲液(pH=7.0)中,然后加入0.1mL的酶液(空白对照是直接加入2mL的100mmol/L磷酸缓冲液),在384nm的波长下用紫外分光光度计测量反应起始时的吸光度值和反应3min后的吸光度值,整个过程在25℃下完成。根据实验组的吸光度变化和对照组吸光度的变化的比较来确定其酯酶活性。酶活定义为:在室温下,每分钟水解1μmol乙酸对硝基苯酯所需的酶量为一个酶活单位。该方法的优点在于操作简单,灵敏度好,而且得到数据更为精确。但是它的缺点在于只能测定具有酯酶活性的碳酸酐酶的酶活,而目前发现绝大多数的β型和γ型碳酸酐酶均没有酯酶活性,因此无法使用该方法进行测定。3碳酸酐酶的酶活测定方法当前对碳酸酐酶的研究一般是集中在根据碳酸酐酶的立体活性结构为依据,拟合出一系列的金属配合物并研究其催化性能;从磺胺类抑制剂的关键抑制结构出发,合成各种碳酸酐酶的抑制剂等。尤其是国内目前对于碳酸酐酶的研究,主要是集中在动植物体中的α型和β型碳酸酐酶,并且以研究其抑制剂为主,所用到的酶活测定方法也主要是测定碳酸酐酶的酯酶活性。本