一种发酵型防腐剂腐乳毛霉高产蛋白酶菌株的分离与鉴定

一种发酵型防腐剂腐乳毛霉高产蛋白酶菌株的分离与鉴定

众所周知，乳腺癌具有良好的营养作用，包括氨基酸、醇酯和其他香料。它含有大量水分、游离氨基酸、游离脂肪、碳酸盐、硫酸钠、钙、磷等养分，而不是胆固醇。其中蛋白质含量高达12%～22%,而且18种氨酸齐全。腐乳生产历史悠久,依据生产使用菌种不同可分为细菌型、根霉型和毛霉型。目前,工业生产中运用最多的是毛霉,主要因其具有菌丛细长柔软,能包裹豆坯形成块状完整的腐乳;其酶系丰富,主要含有内肽酶和端肽酶的复合酶,水解蛋白质无苦味,且无毒无害、不产生怪味和异色等。毛霉菌种的生产性能直接影响到腐乳的产量和质量,而生产企业主要依据感官鉴定,为此,生产菌种在使用过程中出现性状衰退导致生产停滞的情况时有发生。因此,从风味较好的腐乳成品中筛选酶系较完整且产蛋白酶活性较高、发酵性状优良的腐乳毛霉菌株,并应用分子检测手段对其进行准确鉴定具有重要意义。长期以来,对真菌进行分类鉴定主要依据培养和生理生化特征,花费时间长,准确度不够,而通过对真菌的rDNA-ITS序列测定,进行同源性分析,构建系统发育树,具有准确、快速、灵敏的优点,已成为菌株鉴定的有效手段。基于此,本试验通过rDNA-ITS全序列分析,结合生理生化特征对分离菌株进行鉴定,获得了发酵风味较好、产蛋白酶较高的雅致放射毛霉菌株MGC317(以下简称MGC317)。为MGC317菌株应用于生产提供分子理论依据。1材料和方法1.1该菌株的来源1.1.1样品腐乳样品是从贵州各地收集的家庭自制腐乳;自制样品是将市场上购买的豆腐切成块状,让其自然发酵而成;腐乳成品购自贵州省内各大超市。1.1.2hc-7和1.4统一指标菌株的筛选高大毛霉菌株MucormucedostrainMHC-7和雅致放射状毛霉ActinomucorelegansstrainM3118分别购自四川省成都市调味品研究所和中国微生物菌种保藏中心,并作为标准菌株。1.2培养基1.2.1制备组合1/3000孟加拉红100mL、蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂20g,补水至1000mL,分装,114℃灭菌30min,备用。1.2.2克氏培养基蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂20g,补水至1000mL,分装,121℃灭菌30min,备用。1.2.3l/lnahs溶液的配制干酪素4.0g,选用20mL0.1mol/LNaOH溶液溶解后,再加20g的琼脂,用蒸馏水煮沸溶解后定溶至1000mL,分装,121℃灭菌30min,备用。1.2.4山羊皮的生长麸皮90g,水100mL,自然pH值,适量装入250mL三角瓶中,121℃灭菌30min后及时摇散,备用。1.3方法1.3.1察氏培养基平板病原菌分离和培养依据腐乳样品色泽、质地和口感,采用10人品尝小组综合计分,以得分值较高者作为分离毛霉的样品材料。用接种环挑取样品材料上少量菌丝于5mL无菌水中,振摇,制成孢子悬液,在孟加拉红平板培养基上涂布,28℃培养48h,获得20株疑似毛霉菌株,挑取菌丝接种PDA斜面,于4℃下保存。采用透明圈法。取培养48h的察氏培养基平板菌丝,直径为0.25cm2,放入盛有5mL无菌水的小试管中,制成孢子悬液,然后用无菌牙签黏孢子悬液点种在酪蛋白琼脂培养基上,28℃培养48h,观测各菌株的菌落直径和透明圈直径大小。根据透明圈直径大小,获得4株疑似毛霉菌株,其中菌株MGZ-2分离自遵义腐乳;菌株MGC317分离自自制腐乳;菌株MGW-2分离自瓮安腐乳;菌株MGH分离自广合腐乳。取察氏培养基平板菌丝制成孢子悬液,接入麸皮培养基中,于28℃培养48h。称取2g培养48h的麸曲,置于250mL三角瓶中,加入20mL0.1mol/L的磷酸氢盐缓冲液中,捣粹培养物,在40℃水浴中浸提1h,间断搅拌,3000r/min离心10min,取上清液采用文献的方法测定蛋白酶活力。1.4显微观察试验载玻片上加1滴石碳酸棉兰染液,用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝放于其上,轻轻将菌丝体分开,加盖玻片,在显微镜下观察产孢结构、孢子形态与颜色、分生孢子梗着生情况。参照文献、的方法,确定菌株的种属分类。1.5pcr扩增程序0.7%的琼脂糖凝胶检测CTAB法提取的毛霉基因组DNA,以特异性引物P1∶TCCGTAGGTGAACCTGCGC、P2∶TCCTCCGCTTATTGATATGC(由上海生物工程公司合成)扩增rDNA-ITS序列。扩增程序为:94℃,5min;94℃,40s→50℃,30s→72℃,30s(5次循环);94℃,40s→54℃,30s→72℃,30s(25次循环);72℃,5min;4℃,∞。1%的琼脂糖凝胶检测PCR产物后胶回收(依照Takara公司胶回收试剂盒说明书方法进行)。胶回收的PCR产物,连接至pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌TG1,蓝白斑筛选,经菌落PCR、质粒PCR鉴定。1.6序列测量将鉴定的阳性克隆菌株接种LB液体培养基,37℃振荡培养4h后,然后加入40%甘油,送大连宝生物公司测序。1.7列列表登录将筛选获得的目的菌株ITS序列送至Genebank/EMBL/DDBJ数据库中注册。1.8序列同源性比对并进行系统发育树的构建以NCBI数据库中BLAST在Genebank/EMBL/DDBJ/PDB基因库中程序进行序列同源性比对,再通过DNAStar软件包中megAlign程序绘制系统发育树并将其鉴定到种。1.9生长情况测定以高大毛霉菌株MHC-7和雅致放射状毛霉M3118作为对照,称取2g培养48h的毛霉麸曲,置于250mL三角瓶中,加无菌水100mL,捣割培养物,过滤,制备孢子悬液接种于豆腐坯(大小为2.5cm×2.5cm×1.6cm),25～38℃培养至96h,其间检测菌丝的生长情况以及产酶特性。1.10蛋白酶活力测定取1块豆腐毛坯,刮下菌丝并收集,称其重量,置于250mL三角瓶中,加入10倍菌丝量的0.1mol/L磷酸氢盐缓冲液,在40℃水浴中浸提1h,间断搅拌,3000r/min离心10min,取上清液采用文献的方法测定蛋白酶活力。2结果与分析2.1感官评分标准依据腐乳样品色泽、质地和口感,10人品尝小组综合计分,计分情况见表1。本次评分标准采用腐乳生产企业常用的评判规则。表1结果显示,样品中遵义腐乳、瓮安腐乳、自制腐乳和广合腐乳的综合得分都在85分以上,达到优质腐乳的标准,因此将其作为分离毛霉的样品材料。2.2c317菌株的分离蛋白能力从表2中发现,初筛菌株在酪蛋白琼脂培养基上都能良好地生长,其中MGC317菌株在酪蛋白琼脂平板上形成的透明圈直径最大,高于对照菌株,说明其分解蛋白能力最强。总体来看,6个菌株形成透明圈的差异不太明显,容易导致判断偏差,并且4株菌都是疑似毛霉菌株。因此,需对其再进行复筛。2.3菌株的产蛋白酶活力分别取初筛菌株在28℃条件下,于麸皮培养基中生长48h的麸曲,制备蛋白酶粗酶液,再用福林—酚试剂测定酶活力大小。结果显示,菌株MGC317、MGH、MHC-7、M3118、MGW-2、MGZ-2的产蛋白酶活力大小分别为57.26μL、53.02μL、49.68μL、47.96μL、44.80μL、43.58μL。6株菌株的蛋白酶活力都较高,生长较好,其中以MGC317菌株产蛋白酶活力最高。进一步证明了MGC317菌株分解蛋白质形成氨基酸的能力最强。2.4菌落形态、大小及其他病物的形态将MGC317接种查氏培养基,28℃培养48h。其菌落直径为2.8cm左右,呈松絮状,菌丝白色,无假根,但老熟后出现少量分隔,菌丝高度为3.2cm左右(见图1)。菌落底部呈花瓣状扩展,不产生色素;孢囊梗无色,呈单轴分枝;孢子囊呈球形,留有囊领;孢囊孢子无色,呈圆形或椭圆形(见图2)。经形态分类学鉴定,MGC317菌株与毛霉科Mucoraceae、雅致放射毛霉属Actinomucorelegans形态描述极为相似。2.5识别菌株的生物2.5.1植生型mbd3-3基因回复突变株的构建ITS阳性克隆质粒经1%的琼脂糖凝胶电泳,结果显示,2、4、5、7、8号菌株为阳性转化子(见图3),从而获得pMD18-ITS/TG1克隆菌株。测序结果表明,MGC317菌株rDNA-ITS序列分子长为711bp。以此序列登录Genebank,获得登录号为EU131142(gi:157367524)。2.5.2pcr扩增结果将EU131142序列在NCBI网站中使用blast程序在Genebank/EMBL/DDBJ基因库中进行同源性搜索,所得结果中相似性最高的前10个标准菌株比较结果见表3。从表3可见,MGC317与雅致放射状毛霉ITS序列相似性超过96%,最高达97%;而且全部为雅致放射状毛霉菌株。因此,确定毛霉MGC317为雅致放射状毛霉。2.5.3结果表1综合同源性比对结果和雅致放射毛霉菌株在真菌发育系统中的位置,从Genebank中选择10个标准菌株的ITS序列,结果见表4;应用DNAStar软件中megAlign程序绘制系统发育树,结果见图4。图4结果表明,MGC317菌株与雅致放射毛霉菌株的遗传距离比其他菌株小,且MGC317菌株和雅致放射毛霉菌株在一个分支中。由此进一步证明,MGC317菌株为雅致放射毛霉Actinomucorelegans(Eidam)Benjam.etHesselt。2.6结果表明，在腐化前的发酵试验中2.6.1反应时间及生长结果将雅致放射毛霉MGC317、高大毛霉菌株MHC-7和雅致放射毛霉M3118制备孢子悬液,接种于豆腐坯,于不同时间观察菌丝的生长情况,结果见表5。从表5的结果可以判定3株菌株产孢时间、数量及孢子色泽差异不大,仅有菌丝长度存在差异。其中菌株MGC317的菌丝最长,说明其生长最旺盛;其次是MHC-7。2.6.2不同菌株在豆腐坯上的活性从表6结果可见,高大毛霉菌株MHC-7、雅致放射毛霉M3118和雅致放射毛霉MGC317在豆腐坯上培养48h时,蛋白酶活力最大,尤以雅致放射毛霉MGC317最突出。这说明其发酵性状优于高大毛霉菌株MHC-7和雅致放射毛霉M3118。结合菌株筛选结果,表明雅致放射毛霉MGC317是产蛋白酶较高、发酵性状优良的腐乳毛霉菌株。3耐水解毛霉菌株的筛选、鉴定与应用3.1本研究先从贵州各地收集的风味优良的腐乳样品,应用选择性培养基分离发酵菌株,是为了确保分离菌株的发酵性能及风味。获得初筛菌株后进行复筛及形态鉴定。选择公认的16SDNA的ITS序列进行分子比对鉴定,结合形态学鉴定结果筛选出1株产蛋白酶活力高的腐乳毛霉菌株,确定此菌株属于雅致放射毛霉。目前,在腐乳生产企业中,毛霉菌株在连续培养10代后会出现衰退现象而不能再使用,这就需要筛选出产蛋白酶活力较高、发酵性状好的腐乳毛霉菌株进行生产。同时,由于大多数生产菌株未测定16SDNAITS序列,生产企业只能通过菌种生产性能判定其是否衰退,从而忽视了豆坯、配料等因素的影响,严重影响了腐乳的生产品质,给企业造成很大的经济损失。通过检测16SDNAITS序列可以准确判定生产菌种的衰退问题。3.2本研究借鉴文献对耐热性毛霉菌株的筛选、鉴定方法,获得1株产