第三章病毒的增殖

第三章病毒的增殖第1页，课件共65页，创作于2023年2月第三章病毒的增殖一、病毒的复制周期（一）、一步生长曲线（二）、病毒侵染寄主细胞的过程二、病毒的异常复制（非增殖性感染）第2页，课件共65页，创作于2023年2月病毒的增殖方式——复制replication病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。一、病毒的复制周期复制周期（replicativecircle）或称复制循环：自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程。第3页，课件共65页，创作于2023年2月第三章病毒的增殖用于病毒复制研究的实验系统噬菌体——细菌培养系统动物病毒——动物细胞培养系统植物病毒——动植物原生质体培养系统易培养、易控制噬菌斑、易观察生长快，周期短第4页，课件共65页，创作于2023年2月一、病毒的复制周期（一）、一步生长曲线（onestepgrowthcurve）1939年，MaxDelbruck&EmoryEllis：E.coli/bacteriopage1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞2、数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清3、将上述混合物大量稀释4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价5、以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线该实验标志着分子病毒学、分子生物学和分子遗传学的建立，MaxDelbruck因此荣获1969年NobelPrize第5页，课件共65页，创作于2023年2月噬菌体的一步生长曲线第6页，课件共65页，创作于2023年2月一、病毒的复制周期（一）、一步生长曲线（onestepgrowthcurve）噬菌体复制（繁殖）的三个阶段：1、吸附期游离的噬菌体吸附到宿主细胞2、潜伏期从噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的最短时期3、裂解期随着菌体不断破裂，新噬菌体数目增加，直到最高值第7页，课件共65页，创作于2023年2月取培养物直接测定病毒数量将培养物过滤去细胞后测定病毒数量将细胞裂解后测定病毒的数量前期可将培养物先离心去上清以消除未吸附病毒的影响裂解量：每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。其值等于潜伏期受染细胞的数目除以稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。（一）、一步生长曲线（onestepgrowthcurve）第8页，课件共65页，创作于2023年2月隐蔽期（eclipseperiod）在潜伏期的前一段，受染细胞内检测不到感染性病毒，后一阶段，感染性病毒在受染细胞内的数量急剧增加。自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间为隐蔽期。隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系，从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成熟，而不是通过双分裂方式产生的。不同病毒的隐蔽期长短不同例如，DNA动物病毒的隐蔽期为5～20min，RNA动物病毒为2～10h。第9页，课件共65页，创作于2023年2月（一）、一步生长曲线（onestepgrowthcurve）是研究病毒复制的一个经典试验，最初是为研究噬菌体的复制而建立，以后推广到动物病毒和植物病毒复制研究中。以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，离心除去未吸附的病毒，或以抗病毒抗血清处理病毒—细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以min计，动物病毒和植物病毒以h或d计。潜伏期噬菌体的裂解量一般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。裂解量第10页，课件共65页，创作于2023年2月①吸附adsorption/attachment

②侵入penetration/injection

③脱壳uncoating

④病毒大分子的合成病毒基因组的复制与表达⑤装配assembly

⑥成熟maturation

⑦释放release一、病毒的复制周期（二）、病毒侵染寄主细胞的过程第11页，课件共65页，创作于2023年2月1、吸附adsorption/attachment毒粒敏感细胞随机碰撞而接触（静电引力或氢键）可逆吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸附）病毒表面蛋白与细胞受体的结合特异性，不可逆吸附，启动病毒感染的第一阶段（二）、病毒侵染寄主细胞的过程第12页，课件共65页，创作于2023年2月1、吸附VAP(virus-attachmentprotein)与细胞受体receptor间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。不同种系的细胞具有不同病毒的细胞受体，病毒受体的细胞种系特异性决定了病毒的宿主范围。第13页，课件共65页，创作于2023年2月1、吸附分别吸附于大肠杆菌性毛和菌体上的噬菌体第14页，课件共65页，创作于2023年2月1、吸附动物宿主细胞及细菌表面病毒受体的存在可通过生化等实验证明；但至今仍未发现植物病毒的细胞受体存在。第15页，课件共65页，创作于2023年2月1、吸附病毒吸附蛋白VAP：一般由病毒的衣壳蛋白或包膜上的糖蛋白突起充当。如：T偶数噬菌体——噬菌体尾部的尾丝蛋白φx174噬菌体——二十面体衣壳五邻体顶上的纤维突起H蛋白无包膜动物病毒如腺病毒——二十面体衣壳上的五邻体纤维、多瘤病毒——VPl（衣壳蛋白有VPl、VP2和VP3）有包膜动物病毒——病毒包膜上的糖蛋白突起，如副粘病毒——HN糖蛋白、流感病毒——血凝素(HA)糖蛋白，

HIV——gp120糖蛋白、弹状病毒——G糖蛋白，

疱疹病毒——gpB糖蛋白第16页，课件共65页，创作于2023年2月1、吸附在流感病毒包膜上，有两种糖蛋白突起，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)流感病毒的吸附只与HA有关，而与NA无关

（病毒的感染性只能被抗血凝素的抗血清所中和．不能被抗神经氨酸酶的抗血清中和）流感病毒包膜上血凝素(HA)三聚体结构（三亚基）第17页，课件共65页，创作于2023年2月1、吸附流感病毒包膜上血凝素(HA)分4个区1.细胞受体结合区：流感病毒的VAP与宿主细胞表面糖蛋白受体的唾液酸结合，这是HA的主要功能．其受体结合位点位于三聚体的顶端，形似一个裂缝或小口袋。它是病毒包膜糖蛋白HA与细胞受体相互作用的分子基础。2.融合区：

HA蛋白具有促膜融合的活性，但HA只有经蛋白酶切割产生HA1和HA2后才具有融合活性。3.跨膜区：在靠近HA分子的羧基端大约有25个AA残基组成非极性区即HA的跨膜区4.膜内区：HA分子羧基端最后10个AA在病毒包膜内表面。第18页，课件共65页，创作于2023年2月1、吸附影响病毒吸附的环境因素：噬菌体数量：每一敏感细胞所能吸附相应噬菌体的数量m.o.i温度:一般来说．在0~37℃范围内温度越高、病毒吸附效率也越高温度越高，VAP与细胞受体间的碰撞次数愈多，吸附机会越大温度越高．细胞膜中脂质分子的运动越快，其中蛋白质分子的迁移也更加频繁，受体分子更容易与病毒粒子产生多价结合离子：只有在一定的阳离子环境条件下，病毒粒子才能吸附细胞，如Na+、K+可使脊髓灰质炎病毒、腺病毒、流感病毒产生最大量的吸附，2价阳离子Ca2+、Mg2+则能促进噬菌体吸附pH：pH的高低能够引起病毒粒子和细胞表面基团电荷的改变（5~10）其他：某些糖基分子可与细胞受体相互作用，对病毒产生竞争性结合抑制．如单糖分子可以抑制人肠道病毒的血凝作用第19页，课件共65页，创作于2023年2月2、侵入penetration/injection侵入(内化)，一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量的感染步骤。不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同

注射式injection

有尾噬菌体细胞内吞endocytosis动物病毒膜融合fusion有包膜的病毒直接侵入部分动物病毒、无包膜病毒、植物病毒第20页，课件共65页，创作于2023年2月2、侵入penetration/injection(1)部分病毒粒子可直接侵入如脊髓灰质炎病毒、腺病毒。(2)许多无包膜病毒通过VAP与细胞受体结合后，其宿主细胞膜的流动性引起病毒衣壳蛋白重排和构型变化，细胞膜上可能有水解酶，导致病毒粒子释放核酸进入细胞质，病毒衣壳仍留在细胞膜外。实际上将病毒侵入和脱壳融为一体。(3)其他特殊方式：尚未发现植物病毒有特异性细胞受体，通过微伤口或自然孔口、细胞间的胞间连丝，或昆虫的口器侵入细胞。

许多病毒并非仅有一种侵入方式，可能几种侵入方式并存直接侵入第21页，课件共65页，创作于2023年2月2、侵入有尾噬菌体注射方式将噬菌体核酸注入细胞通过尾部刺突固着于细胞；尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔；尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入胞内，蛋白质外壳留在胞外；吸附尾钉固着尾鞘收缩尾管穿入DNA注入如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引起细胞立即裂解，但噬菌体并未增殖，这种现象称为自外裂解（lysisfromwithout）。第22页，课件共65页，创作于2023年2月2、侵入动物病毒①直接穿过细胞膜的移位方式③细胞的内吞功能②毒粒包膜与细胞质膜的融合第23页，课件共65页，创作于2023年2月2、侵入植物病毒通过人为或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动蛋白（movementprotein）与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。第24页，课件共65页，创作于2023年2月3、脱壳uncoating病毒侵入后，病毒的包膜和/或壳体除去而释放出病毒核酸的过程。脱壳是病毒基因组进行功能表达所必需的感染事件。T-偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生的动物病毒存在不同的结构类型和不同的侵入方式，其脱壳过程也较复杂。病毒的毒粒消失，失去原有的感染性，进入潜隐期。第25页，课件共65页，创作于2023年2月3、脱壳uncoating第26页，课件共65页，创作于2023年2月遗传的中心法则转录翻译复制DNAmRNAProtein

逆转录（半保留不连续复制）4、病毒大分子的合成(replication）全保留复制模式：多数dsRNA病毒第27页，课件共65页，创作于2023年2月4、病毒大分子的合成病毒基因组的复制与表达存在着强烈的时序性病毒基因组进入胞内宿主细胞的代谢发生改变病毒利用宿主的生物合成机构和场所，使病毒核酸表达和复制，产生大量的病毒蛋白质和核酸。第28页，课件共65页，创作于2023年2月早期蛋白：中期mRNA聚合酶、更改蛋白质等中期蛋白：DNA聚合酶、晚期mRNA聚合酶等晚期蛋白：头部蛋白、尾部蛋白、装配蛋白、溶菌酶等第29页，课件共65页，创作于2023年2月ⅦdsDNADNA肝炎病毒具有RNA中间体+mRNAⅡ+DNA细小病毒科Ⅵ+RNA逆转录病毒Ⅰ

dsDNA腺病毒、疱疹病毒Ⅳ+RNA冠状病毒科蛋白质ⅢdsRNA呼肠孤病毒科Ⅴ-RNA正粘病毒科病毒的基因组类型及复制表达途径dsDNAdsDNA-ssDNA+RNAdsDNA发生在成熟过程中的病毒粒子内第30页，课件共65页，创作于2023年2月Transcriptionofvirusgenomes第31页，课件共65页，创作于2023年2月逆病毒复制：mRNA潜伏杂种双链第32页，课件共65页，创作于2023年2月逆病毒复制过程1：１、进入细胞；２、反转录在反转录酶的作用下以病毒RNA为模板合成DNA，然后再形成线形dsDNA;３、整合

DNA拷贝整合到宿主基因组中；４、转录病毒DNA转录形成病毒mRNA和子代病毒RNA;５、壳体化在细胞质中产生核衣壳；６、出芽粒子在细胞质膜处以出芽方式放出.HIVreplication3HIV2第33页，课件共65页，创作于2023年2月主要是一种DNA聚合酶，表现出三种酶活性：①以RNA为模板合成DNA(反转录)；②以DNA为模板合成DNA;③RNA酶H活性(降解RNA:DNA杂交链中的RNA链)反转录酶在进行DNA合成时需要的引物是特异的细胞内tRNA．用作引物的tRNA的类型依病毒种类而不同，是从以前的宿主细胞带入病毒粒子的。如：Roussarcoma(肉瘤)

virus使用色氨酸tRNA。逆转录酶reversetranscriptase第34页，课件共65页，创作于2023年2月从逆转录v形成dsDNA的步骤1第35页，课件共65页，创作于2023年2月从逆转录v形成dsDNA的步骤2第36页，课件共65页，创作于2023年2月逆转录病毒的复制+RNA第37页，课件共65页，创作于2023年2月DNA肿瘤病毒引起细胞转化的模式图dsDNA如SV40病毒的全部或部分DNA整合到宿主细胞DNA中；编码转化信息的病毒基因被转录并被剪切为病毒mRNA分子，然后转运到胞浆被翻译成转化蛋白或T抗原。T抗原能使得宿主细胞转变为癌细胞第38页，课件共65页，创作于2023年2月-RNA病毒增殖如：弹状病毒第39页，课件共65页，创作于2023年2月单纯疱疹病毒复制dsDNA第40页，课件共65页，创作于2023年2月5、病毒的装配、成熟与释放装配(assembly)：亦称形态发生(morphogenesis)新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒释放release成熟的子代病毒颗粒然后依一定途径释放到细胞外病毒的释放标志病毒复制周期结束成熟（maturation）涉及病毒粒子的结构变化（蛋白构型），抗原差异第41页，课件共65页，创作于2023年2月T4噬菌体的装配是一个极为复杂的自我装配的过程第42页，课件共65页，创作于2023年2月大多数噬菌体都是以裂解细胞方式释放第43页，课件共65页，创作于2023年2月丝杆噬菌体（如M13或fd）不杀死细胞，子代毒粒以分泌方式不断从受染细胞中释放，并同时完成毒粒的组装。5、病毒的装配、成熟与释放第44页，课件共65页，创作于2023年2月有包膜病毒的装配与释放有时也是同时完成的第45页，课件共65页，创作于2023年2月有包膜的动物病毒是在从宿主细胞核芽出或细胞质膜芽出的过程中裹上包膜而形成包膜病毒第46页，课件共65页，创作于2023年2月TMV的装配：RNA穿过螺旋的中心孔并在生长端形成一个可移动的环。第47页，课件共65页，创作于2023年2月吸附侵入早期：病毒特异性酶的合成病毒核酸复制病毒结构蛋白质合成装配释放病毒大分子合成脱壳成熟第48页，课件共65页，创作于2023年2月裸病毒生活周期第49页，课件共65页，创作于2023年2月二病毒的非增殖性感染增殖性感染（productiveinfection）感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞内，并以有感染性病毒子代产生为特征。非增殖性感染（nonproductiveinfection）感染由于病毒、或是细胞的原因，致使病毒的复制在病毒进入敏感细胞后的某一阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然亦可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。第50页，课件共65页，创作于2023年2月1、流产感染（abortiveinfection）依赖于细胞的流产感染：如病毒感染的细胞是病毒不能复制的非允许细胞(nonpermissivecell)，将导致流产感染依赖于病毒的流产感染:由基因组不完整的缺损病毒(defectivevirus)引起。这类病毒因一个或多个病毒复制必需基因有缺损，丧失了其功能，所以它们无论是感染允许细胞还是非允许细胞，都不能完成复制循环。病毒的非增殖性感染第51页，课件共65页，创作于2023年2月2、限制性感染（restrictiveinfection）因细胞的瞬时允许性产生，导致:(1)病毒持续存在于受染细胞内不能复制，直到细胞成为允许性细胞，病毒才能繁殖；(2)一个细胞群体中仅有少数细胞产生病毒子代。

3、潜伏感染（latentinfection）在受染细胞内有病毒基因组持续存在，但并无感染性病毒颗粒产生，受染细胞也不会被破坏。潜伏感染的另一个极端情况是由于病毒基因的功能表达导致宿主基因表达的改变——恶性细胞。第52页，课件共65页，创作于2023年2月温和噬菌体的溶源性反应烈性噬菌体（virulentphage）感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环（lyticcycle）。温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenicphage）感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。这一现象称做溶源性（lysogeny）现象在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如λ噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在(如P1噬菌体)。第53页，课件共65页，创作于2023年2月温和噬菌体的溶源性反应整合于细菌染色体或以质粒形成存在的温和噬菌体基因组称做原噬菌体（prophage）在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称溶源性细菌（lysogenicbacteria）溶源性细菌经自发裂解或诱发裂解，进入裂解循环第54页，课件共65页，创作于2023年2月溶源性感染对细胞的影响被温和噬菌体感染后形成的溶源性细菌具有“免疫性”，即其它同类噬菌体虽然可以再次感染该细胞，但不能增殖，也不能导致溶源性细菌裂解。免疫性是由原噬菌体产生的阻遏蛋白的可扩散性质所决定的。溶源性细菌有时还能获得一些新的生理特性，例如白喉杆菌只有在含有特定类型的原噬菌体时才能产生白喉毒素，引起被感染机体发病。原噬菌体引起的溶源性细菌除免疫性外的其他表形改变，包括溶源菌细胞表面性质的改变和致病性转变被称为溶源转变(lysogenicconversion)。溶源菌中的温和噬菌体基因组通常不影响细胞的繁殖功能，但它们可能引起其他的细胞变化。(1)免疫性(2)溶源转变第55页，课件共65页，创作于2023年2月λ噬菌体的的溶源性反应进入宿主后线状基因组依靠粘性末端环化第56页，课件共65页，创作于2023年2月λ噬菌体的基因组dsDNA，总长度为48502bp。DNA分子的两端、各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5'单链突出序列，即粘性末端。控制λ噬菌体复制转录的基因：①头部基因—编码头部与包装蛋白的基因(A-F)②尾部基因—编码尾部蛋白(z-J)③重组基因—int,xis,exo,red,gam等基因与识别位att，其功能是行使整合、重组和切割④正调控基因—N和Q，N为抗转录终止基因，Q为抗终止子基因，Q蛋白为晚期正调控因子⑤负调控基因—CI、CII、CIII和cro⑥DNA合成基因—O、P基因⑦裂解基因—S、R基因第57页，课件共65页，创作于2023年2月λ噬菌体的的溶源性反应基因组的表达与复制存在着强烈的时序性第58页，课件共65页，创作于2023年2月λ噬菌体的基因组λ噬菌体的基因组：（4个基因簇）调节区(regulation)重组有关的区域(recombination)复制区(replication)结构基因区(包括头、尾、装配和裂解有关的基因)

λ基因组有三个调节基因——N、Cro和QN蛋白抗终止子t1，tR1和tR2Q蛋白抗终止子tR4cro蛋白对CI和Cro基因的转录起负调控作用第59页，课件共65页，创作于2023年2月λ噬菌体的的溶源性反应溶源化有关的有三个基因——CI、CⅡ和CⅢCⅢ蛋白使CⅡ蛋白稳定；CⅡ/CⅢ蛋白能使CI基因启始转录；CI蛋白是λ阻遏物，能使与复制成熟和裂解等有关的基因都不转录，使λ噬菌体处于溶源状态。

λ噬菌体的溶源途径CI蛋白