第三章基因工程载体

第三章基因工程载体第1页，课件共129页，创作于2023年2月基因克隆载体要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。基因克隆载体(DNA克隆载体)：通过不同途径能将承载的外源DNA片段(基因)带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。第2页，课件共129页，创作于2023年2月载体的功能及特征一、发展概况

1.

第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)

2.

第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。

3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。

第3页，课件共129页，创作于2023年2月载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第4页，课件共129页，创作于2023年2月载体应具备的条件在克隆载体DNA分子合适的位置有一至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。克隆载体必须是安全的。第5页，课件共129页，创作于2023年2月第6页，课件共129页，创作于2023年2月第一节

质粒克隆载体第7页，课件共129页，创作于2023年2月一、质粒的一般生物学特性发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。第8页，课件共129页，创作于2023年2月一、质粒的一般生物学特性质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的形式存在。在体外理化因子作用下，质粒可以成为开环DNA分子（oc-DNA）或线形DNA分子（l-DNA）。在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子（ss-DNA）。质粒DNA分子大小1-100Kb以上。第9页，课件共129页，创作于2023年2月质粒DNA的复制质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯双向性（F质粒）；既有单向又有双向性（R6K）。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1–数个拷贝stringentplasmid松弛型复制控制的质粒10个拷贝以上stringentplasmid第10页，课件共129页，创作于2023年2月质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合ori

E.coliColE1

plasmid复制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’第11页，课件共129页，创作于2023年2月质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制

控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep第12页，课件共129页，创作于2023年2月第13页，课件共129页，创作于2023年2月质粒的不亲和性有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容第14页，课件共129页，创作于2023年2月第15页，课件共129页，创作于2023年2月质粒迁移革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定第16页，课件共129页，创作于2023年2月携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义第17页，课件共129页，创作于2023年2月质粒载体第18页，课件共129页，创作于2023年2月第19页，课件共129页，创作于2023年2月二、构建质粒克隆载体的基本策略1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。2、含有尽可能多的克隆位点。3、含有供选择克隆子的标记基因。4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。第20页，课件共129页，创作于2023年2月三、质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的设计和构建过程的原则选择合适的出发质粒（亲本质粒）。正确获得构建质粒克隆载体的元件。组装合适的选择标记基因。选用合适的启动子。在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构建过程力求简单。第21页，课件共129页，创作于2023年2月大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建pBR322的构建是质粒载体构建的一个典范。pBR322的亲本质粒pSF2124，含有Amp抗性基因pMB1，含有松弛型ColE1的复制起点（ori）Psc101，含有Tet抗性基因第22页，课件共129页，创作于2023年2月大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建1、在菌体内将R1drd19质粒（沙门氏菌中R1质粒的一种变异体）的易位子Tn3（携带有Amp抗性基因）易位到pMB1质粒上，构成一个较大的质粒pMB3(13.3Kb)。pMB3AATT黏性末端环化导入大肠杆菌pMB8(2.6Kb)EcoRI*第23页，课件共129页，创作于2023年2月2、从质粒pSC101获得四环素抗性基因（Tetr)。获得pMB9（5.3Kb)第24页，课件共129页，创作于2023年2月3、向pMB9引入Amp抗性基因。pSF2124的Tn3体内易位至pMB9获得pBR312(10.2Kb,具有Amp抗性基因和Tet抗性基因）pBR312pBR313(8.8Kb，除去Amp抗性基因中的BamHI位点）EcoRI*第25页，课件共129页，创作于2023年2月4、pBR313pBR322(4.3Kb)pBR320(2.8Kb)pBR318（6.3Kb)去除两个PstIEcoRII片断去掉酶切酶切体外重组第26页，课件共129页，创作于2023年2月第27页，课件共129页，创作于2023年2月四、常用质粒载体类型1、克隆质粒载体2、表达质粒载体3、多功能质粒载体4、穿梭质粒载体第28页，课件共129页，创作于2023年2月1、克隆质粒载体克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁殖的质粒载体。pBR322质粒pUC系列的质粒载体第29页，课件共129页，创作于2023年2月pBR322质粒具有较小的分子量，大小4363bp可以克隆大到6Kb的外源DNA片断具有两种选择标记，即Ampr和Tetr。具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点Amp抗性基因内可被PstI,PvuI,SacI切开，Tet抗性基因可被BamHI,HindIII切开，通过插入失活筛选重组子。在宿主细胞内具有较高的拷贝数。一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。第30页，课件共129页，创作于2023年2月CAPproteinbindingsite-591-554(compl.strand);mRNA(LacZ)startsatntposition507(compl.strand);lacrepressorbindingsite-507-487(compl.strand).第31页，课件共129页，创作于2023年2月pBR322插入失活效应第32页，课件共129页，创作于2023年2月筛选重组子的示意图第33页，课件共129页，创作于2023年2月

BamHI片段(Tcr)

pBR322PstI(Apr)片段

重组分子I

重组分子Ⅱ(ApsTcr)(AprTcs）

PstI片段

外源DNABamHI片段利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程重组分子I

涂布Ap平板Apr转化子

分别转化E.coli(ApSTcS)重组分子Ⅱ涂布Tc平板Tcr转化子影印到Tc平板上AprTcS为重组子AprTcr为原载体

影印到Ap平板上ApSTcr为重组子即为非重组子第34页，课件共129页，创作于2023年2月pUC系列的质粒载体pBR322质粒的复制起点Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制性核酸内切酶的单一酶切位点大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基因

位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点(MCS，multiplecloningsites)区，但它并不破坏该基因的功能

第35页，课件共129页，创作于2023年2月第36页，课件共129页，创作于2023年2月MultipleCloningSitespUC18pUC19第37页，课件共129页，创作于2023年2月第38页，课件共129页，创作于2023年2月pUC系列质粒载体的优点

具有更小的分子量和更高的拷贝数pUC8为2750bp，pUCl8为2686bppBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致rop基因的缺失适用于组织化学方法检测重组体

LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β—半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做α—互补。具有多克隆位点MCS区pUC质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上第39页，课件共129页，创作于2023年2月pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第40页，课件共129页，创作于2023年2月利用菌落颜色筛选重组子第41页，课件共129页，创作于2023年2月2、表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载体（胞内表达载体）和分泌型表达载体根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核细胞表达载体第42页，课件共129页，创作于2023年2月表达载体与克隆载体的区别强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因有效的转录在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白质翻译在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性第43页，课件共129页，创作于2023年2月表达型载体（expressionvector）

特点基因的启动子序列和终止子序列一般无检测标记基因克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。结构转化单元--宿主细胞转化表达单元--外源基因表达第44页，课件共129页，创作于2023年2月表达型载体（expressionvector）

类型

Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+终止子Ⅱ型:转录起始区终止子+翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+终止子Ⅲ型:转录起始区+翻译起始区+信号肽链编码区+终止子（常称之为表达分泌型载体）第45页，课件共129页，创作于2023年2月三种表达型载体结构图第46页，课件共129页，创作于2023年2月表达型载体（expressionvector）显然,不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定,表达载体的类型也就确定了。用途表达外源基因以产生大量外源基因产物用于构建cDNA文库第47页，课件共129页，创作于2023年2月3、多功能质粒载体载体具有多种功能，根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。pGEM系列质粒载体就是一类多功能载体，如：pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM4Z、pSP64、pSP65、pGEM3Zf。第48页，课件共129页，创作于2023年2月pGEM系列载体

pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体。在其总长度为2743bp的基因组DNA中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ’基因。在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。第49页，课件共129页，创作于2023年2月pGEM3Z载体pGEM3Z与pUC载体非常相似

，其不同点：pGEM3Z含有两段额外的短的DNA片段，每一段可以作为RNA聚合酶的识别位点。这两段启动子（噬菌体SP6\T7)存在于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组的pGEM3Z载体中加入RNA聚合酶，可以发生转录。合成的RNA可以作为探针使用，或者研究RNA的加工过程或者蛋白质的合成。第50页，课件共129页，创作于2023年2月第51页，课件共129页，创作于2023年2月2743bpMCSlacZ’PT7oriAprPgem-3EPSP6注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等第52页，课件共129页，创作于2023年2月第53页，课件共129页，创作于2023年2月1、克隆载体，全长3.19kb，具有Amp抗性基因和复制起始点2、MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子---可进行体外转录；为插入片段的测序提供特异引物位点3、MCS为于lacZ’基因内部（插入失活）—蓝白斑筛选4、引入丝状噬菌体f1(+)复制起始点-----可以产生单链DNA，并分泌至上清中，第54页，课件共129页，创作于2023年2月第55页，课件共129页，创作于2023年2月第56页，课件共129页，创作于2023年2月分泌型融合表达载体，有两个启动子（Plac,Pspa），启动子下游装有SPA的信号肽序列和两个结构基因ZZ。产生与SPA蛋白ZZ段融合的蛋白，并可将融合蛋白分泌出胞4.59kb，含Amp抗性基因和原核复制起始点有f1复制起始点，可产生单链DNA第57页，课件共129页，创作于2023年2月4、穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。特点：质粒载体可以携带外源DNA序列在不同物种的细胞之间，特别是在原核和真核之间往返穿梭。常见的穿梭质粒载体：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体等。第58页，课件共129页，创作于2023年2月第59页，课件共129页，创作于2023年2月穿梭质粒

能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。很多酵母菌的穿梭载体，用于功能互补法分离、鉴定真核生物基因的研究

第60页，课件共129页，创作于2023年2月第二节λ噬菌体载体第61页，课件共129页，创作于2023年2月一、λ噬菌体的生物学特性λ噬菌体的生活周期λ噬菌体的基因组结构和功能λ噬菌体的DNA复制第62页，课件共129页，创作于2023年2月1、λ噬菌体的生活周期l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成第63页，课件共129页，创作于2023年2月第64页，课件共129页，创作于2023年2月2、λ噬菌体的基因组结构和功能l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因线状ds-DNA，两端具有12bp5‘-突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’）该末端称为cos位点，可被λ编码的末端酶所识别第65页，课件共129页，创作于2023年2月第66页，课件共129页，创作于2023年2月第67页，课件共129页，创作于2023年2月2、λ噬菌体的基因组结构和功能人为将λ噬菌体基因组分为3个区域：左侧区：自基因A到基因J，包含外壳蛋白的全部编码基因。中间区：介于基因J和基因N之间，这个区又称为非必需区，与噬菌斑形成无关，被外源DNA片断取代后，并不影响噬菌体的生命活动。中间区包含重组基因和一整合切割基因。右侧区：位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基因和裂解基因。第68页，课件共129页，创作于2023年2月3、λ噬菌体的DNA复制裂解周期早期：环状的λDNA分子按θ型双向复制，复制起点位于O基因内，需要O、P基因编码蛋白的参与。晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从θ型转变为滚环型复制，合成出一系列λDNA线性排列的多聚体分子。cos位点是λ噬菌体正确包装的必需位点。第69页，课件共129页，创作于2023年2月第70页，课件共129页，创作于2023年2月3、λ噬菌体的DNA复制溶原性周期λDNA复制以另外一种形式进行，稳定的整合到宿主染色体上并随之一起复制。cI基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现。原噬菌体的删除作用整合作用需要int基因的表达，是一种可逆的过程：一方面，噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上，成为原噬菌体；另一方面，在适当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和int基因的协同作用才能实现。第71页，课件共129页，创作于2023年2月二、

λ噬菌体载体的构建（一）构建λ噬菌体载体的基本原理（二）构建λ噬菌体载体的基本内容1、除去多余的限制酶识别位点2、切除掉λDNA的非必需区3、引入适当的选择标记4、引入无义突变第72页，课件共129页，创作于2023年2月（一）构建λ噬菌体载体的基本原理野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆载体原因λDNA基因组中同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源DNA插入—体内突变和建立新的克隆位点。λ噬菌体头部只能容纳自身DNA的75-105%，即39-52.5Kb，天然λ仅可插入2.5Kb外源DNA片段—除去所有与λ裂解无关的基因和空白区，最大可插入22Kb。第73页，课件共129页，创作于2023年2月第74页，课件共129页，创作于2023年2月（二）构建λ噬菌体载体的基本内容1、除去多余的限制酶识别位点天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI5个，HindIII7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λDNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。第75页，课件共129页，创作于2023年2月通过自然选择法筛选无EcoRI识别位点的λ-噬菌体

第76页，课件共129页，创作于2023年2月（二）构建λ噬菌体载体的基本内容插入型载体只具有一个限制性核酸内切酶的酶切位点可供外源DNA插入的λ噬菌体派生载体承载10Kb以内外源DNA片断取代型载体具有两个限制性核酸内切酶的酶切位点，它们之间的DNA片断可被外源DNA片断取代承载20Kb左右外源DNA片断有多克隆位点，即可用作插入型又可用作取代型第77页，课件共129页，创作于2023年2月体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）l-DNA载体的构建：缩短长度插入型载体第78页，课件共129页，创作于2023年2月体外包装体外包装插入片段最小装载长度10kb（51–26）载体长度26kb插入片段最大装载长度25kb（36–26）l-DNA载体的构建：缩短长度取代型载体第79页，课件共129页，创作于2023年2月（二）构建λ噬菌体载体的基本内容2、切除掉λDNA的非必需区载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去第80页，课件共129页，创作于2023年2月（二）构建λ噬菌体载体的基本内容3、引入适当的选择标记通过组织化学方法进行重组子的筛选加装选择标记lacZ不同的噬菌斑形态可作为筛选重组子的标记imm434基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑第81页，课件共129页，创作于2023年2月（二）构建λ噬菌体载体的基本内容4、引入无义突变琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株第82页，课件共129页，创作于2023年2月三、常用的λ噬菌体载体插入灭活型载体

Charon2、Charon6、lgt11取代型载体lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正选择型载体lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑第83页，课件共129页，创作于2023年2月第84页，课件共129页，创作于2023年2月第85页，课件共129页，创作于2023年2月第三节单链DNA噬菌体载体优越性能克隆较大的DNA片断，包装M13DNA的6倍产生大量含有外源DNA序列的单链DNA分子测定外源DNA片断的插入方向可从大肠杆菌中制备双链的复制型DNA两种形式的DNA分子都能够转染感受态的大肠杆菌，或产生噬菌斑第86页，课件共129页，创作于2023年2月一、M13噬菌体的生物学特性（一）M13噬菌体的基因组结构（二）M13噬菌体感染、复制及包装第87页，课件共129页，创作于2023年2月（一）M13噬菌体的基因组结构基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ编码特异性蛋白质，参与病毒颗粒的组装基因Ⅱ参与DNA复制基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ编码M13的结构蛋白基因Ⅴ参与单链复制过程中的环化作用基因Ⅵ是衣壳蛋白的重要组成部分第88页，课件共129页，创作于2023年2月IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ‘polylinker第89页，课件共129页，创作于2023年2月（二）M13噬菌体感染、复制及包装复制过程：ss（+）RF(0-1min)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min→∞)DNA包装无严格限制第90页，课件共129页，创作于2023年2月+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV感染周期第91页，课件共129页，创作于2023年2月第92页，课件共129页，创作于2023年2月二、M13噬菌体载体的构建M13-DNA上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是插入标记基因如，lacZ'、多克隆位点，消除多余的酶切位点。在M13上引入lacZ’基因，产生了M13mp1，这样就可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。

M13mp1载体不含有任何的单一切点的的识别序列，在基因的起始端，含有6碱基的序列GCATTC，是一个EcoRI位点，这是通过体外定点突变获得的，产生了M13mp2。M13mp2是最简单的M13克隆载体，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位点，在X-gal培养基上可以很容易的区别出来。

M13载体的构建的第二步是将限制性内切酶位点引入lacZ’基因，这一步是通过合成短的多聚核苷酸称为polylinker，含有一系列的限制性位点和EcoRI粘端，完成的。多聚接头插入到M13mp2的EcoRI位点上，就产生了M13mp7。第93页，课件共129页，创作于2023年2月第94页，课件共129页，创作于2023年2月第95页，课件共129页，创作于2023年2月第96页，课件共129页，创作于2023年2月CoordinatesofM13mp18/19genes(terminationcodonsincluded):I3196-4242

II6849-831

III1579-2853

IV4220-5500

V843-1106

VI2856-3194

VII1108-1209

VIII1301-1522

IX1206-1304

X496-831M13mp18M13mp19第97页，课件共129页，创作于2023年2月三、M13噬菌体载体的主要功能最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链，用途：

（1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序

（2）用于单链DNA的定点诱变

（3）用于合成探针第98页，课件共129页，创作于2023年2月第99页，课件共129页，创作于2023年2月四、噬菌粒（Phagemid）载体

质粒与M13-DNA的重组体带有质粒上的酶切位点及标记基因，这样更于筛选及克隆由于不含包装蛋白基因，载体本身长度减少，装载量增大，比质粒大，但不及λ-DNA。第100页，课件共129页，创作于2023年2月第101页，课件共129页，创作于2023年2月第102页，课件共129页，创作于2023年2月第103页，课件共129页，创作于2023年2月第四节粘粒载体（cos质粒载体）第104页，课件共129页，创作于2023年2月第四节粘粒载体（cos质粒载体）l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb和1.5kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA考斯质粒是一类人工构建的含有l-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体第105页，课件共129页，创作于2023年2月第四节粘粒载体（cos质粒载体）能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围不能体内包装，不裂解受体细胞第106页，课件共129页，创作于2023年2月第107页，课件共129页，创作于2023年2月第108页，课件共129页，创作于2023年2月第五节其他载体一、人工染色体二、植物基因工程载体三、动物基因工程载体第109页，课件共129页，创作于2023年2月酵母人工染色体第110页，课件共129页，创作于2023年2月酵母菌人工染色体

YAC可接受100-1000kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具第111页，课件共129页，创作于2023年2月酵母菌人工染色体YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列酵母染色体的复制子酵母染色体的中心粒序列酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为100-2000kbpYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1第112页，课件共129页，创作于2023年2月pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI连接转化酵母菌重组酵母染色体第113页，课件共129页，创作于2023年2月细菌人工染色体很多真核生物基因长度在50kb以上。细菌人工染色体(BAC)载体就是为克隆更大的外源DNA片段而设计构建的

细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间第114页，课件共129页，创作于2023年2月载体容量M13mp载体<4kb细菌质粒载体<10kbλ载体<23kbcos质粒载体<48kbP1载体<95kbpYAC载体∽1000kb

第115页，课件共129页，创作于2023年2月PlantcloningvectorsTi质粒:侵染广泛的双子叶植物T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列(T-DNAbordersequence)。去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性无明显影响。毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。长度约35kb，和T-DNA处于不同位置第116页，课件共129页，创作于2023年2月Ti质粒及其衍生载体Ti质粒包括五个区域1.LB与RB之间的T-DNA，这段序列整合到植物基因组中2.质粒转移区(PT)3.冠瘿碱代谢区4.复制原点5.毒性区第117页，课件共129页，创作于2023年2月Ti质粒及其衍生载体T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。第118页，课件共129页，创作于2023年2月Ti质粒及其衍生载体Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体：（1）双元载体(binaryvectors）如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记（2）共整合载体(integratedvectors)第119页，课件共129页，创作于2023年2月CaMV克隆载体含1个约8kb的环状双链DNA分子；用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移；其感染对植物有害，不能直接做载体；CaMV的DNA在植物细胞中能高水平转录35SRNA，其启动子是一强启动子。构建的含35S启动子的系列克隆载体可在植物细胞内高效表达基因。第120页，课件共129页，创作于2023年2月第121页，课件共129页，创作于2023年2月Cloningvectorsofanimalcell动物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物5243bp共价闭合环状分子感染率高，几乎100％寄主细胞能被感染能提供完整的真核基因转录所需的成分侵染性具有寄主特异性改建：野生型最多只能包装其基因组长度的1.05倍的DNA分子其他：痘苗病毒DNA作载