高效液相色谱法同时检测饲料中6种磺胺类药物

高效液相色谱法同时检测饲料中6种磺胺类药物

1磺属性1.1磺胺类药物的抗菌性能及抗菌作用氨基磺酸是合成的一种抗高血压药物。这是一种含有氨基丙烯酸的药物的总称。它是一种用于预防和治疗细菌感染疾病的化疗药物。有几种应用广泛有效，疗效也有一定疗效。在饲料中比较经常使用和添加的6种磺胺类药物有磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉和磺胺二甲氧嘧啶。磺胺类药物具有抗菌谱较广、性质稳定和使用简便等特点,当多种磺胺类药物联合使用时可使其抗菌作用增强,治疗范围扩大。由于磺胺类药物具有抑菌作用较为明显的特点,尤其是对被饲喂动物肠道感染治疗效果很好,所以经常被添加到饲料中用作预防痢疾等疾病。但细菌对磺胺较易产生抗药性,为达到疗效,药物使用量越用越大。长期使用也会使动物体内致病细菌产生变异,给动物疾病检疫与防制带来不利影响,而且也会使磺胺类药物残留在被饲喂动物的肌肉等组织中,人食用后给人体健康带来不利影响,甚至会使人体内菌群失衡,对磺胺产生耐药性。1.2高效液相色谱法饲料样品中磺胺类药物经乙腈振荡提取后,用碱性氧化铝小柱净化,注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离,用紫外检测器检测,与标准样品峰面积进行比较,外标法计算磺胺类药物的含量。1.3标准药品及标准产品除非另有规定,在分析中用水应符合化验室用水GB/T6682-1992中规定的三级用水。冰乙酸:优级纯;乙腈:色谱纯;甲醇:色谱纯;流动相:量取150mL甲醇,乙腈150mL,冰乙酸15mL,用超纯水定容至1000mL容量瓶中,摇匀,过0.45μm无机相滤膜,氦气脱气(或超声脱气)备用;标准药品(国家标准物质中心提供):磺胺嘧啶标准品:纯度≥97%;磺胺二甲基嘧啶标准品:纯度≥97%;磺胺间甲氧嘧啶标准品:纯度≥97%;磺胺甲恶唑标准品:纯度≥97%;磺胺喹恶啉标准品:纯度≥97%;磺胺二甲氧嘧啶标准品:纯度≥97%。1.3.1质量浓度的测定磺胺嘧啶标准贮备液:准确称取100mg磺胺嘧啶标准品,精确至0.0001g,置于100mL棕色容量瓶中,用甲醇完全溶解,并定容至刻度,摇匀,该溶液中磺胺嘧啶质量浓度为1mg/mL,于-16℃保存可使用6个月。磺胺二甲基嘧啶标准贮备液:准确称取100mg磺胺二甲基嘧啶标准品,精确至0.0001g,置于100mL棕色容量瓶中,用甲醇完全溶解,并定容至刻度,摇匀,该溶液中磺胺二甲基嘧啶质量浓度为1mg/mL,于-16℃保存可使用6个月。磺胺间甲氧嘧啶标准贮备液:准确称取100mg磺胺间甲氧嘧啶标准品,精确至0.0001g,置于100mL棕色容量瓶中,用甲醇完全溶解,并定容至刻度,摇匀,该溶液中磺胺间甲氧嘧啶质量浓度为1mg/mL,于-16℃保存可使用6个月。磺胺甲恶唑标准贮备溶液:准确称取100mg磺胺甲恶唑标准品,精确至0.0001g,置于100mL棕色容量瓶中,用甲醇完全溶解,并定容至刻度,摇匀,该溶液中磺胺甲恶唑的质量浓度为1mg/mL,于-16℃保存可使用6个月。磺胺喹恶啉标准贮备液:准确称取100mg磺胺喹恶啉标准品,精确至0.0001g,置于100mL棕色容量瓶中,用甲醇完全溶解,并定容至刻度,摇匀,该溶液中磺胺喹恶啉的质量浓度为1mg/mL,于-16℃保存可使用6个月。磺胺二甲氧嘧啶标准贮备液:准确称取100mg磺胺二甲氧嘧啶标准品,精确至0.0001g,置于100mL棕色容量瓶中,用甲醇完全溶解,并定容至刻度,摇匀,该溶液中磺胺二甲氧嘧啶的质量浓度为1mg/mL,于-16℃保存可使用6个月。1.3.2标准贮备液和标准贮备液配制准确吸取0.5mL磺胺嘧啶标准贮备液,磺胺二甲基嘧啶标准贮备液0.5mL,磺胺间甲氧嘧啶标准贮备液0.5mL,磺胺甲恶唑标准贮备液0.5mL,磺胺喹恶啉标准贮备液0.5mL,磺胺二甲氧嘧啶标准贮备液0.5mL,至同一10mL棕色容量瓶中,用流动相定容至刻度,摇匀,此溶液质量浓度相当于50μg/mL。于4℃保存可使用1个月。1.3.3流动相定容液配制准确吸取6种磺胺标准中间工作液1mL,用流动相定容至10mL容量瓶中,摇匀,此溶液质量浓度相当于5μg/mL,当日配制使用。1.4固相萃取spe的测定电子天平(精确至0.0001g)、旋涡振荡器(0～2500r/min)、超声波清洗器、高效液相色谱仪(带紫外检测器)、离心机(0～1万r/min)、针管过滤器:备0.45μm有机微孔滤膜、碱性氧化铝固相萃取(SPE)小柱:小柱内容量12mL,碱性氧化铝填充量2000mg。1.5测试步骤1.5.1超声提取称取5g饲料样品(精确至0.0001g),至具塞离心管中,加入乙腈10mL,于旋涡振荡器上2000r/min振荡1min,置于超声波清洗器超声提取5min,6000r/min离心5min,移取全部上清液至另一离心管中;原离心管中再加入乙腈10mL,于旋涡振荡器上2000r/min振荡1min,超声波清洗器超声提取5min,6000r/min离心5min,转移全部上清液,合并2次离心后上清液。1.5.2碱土中碱干洗脱温度的测定先将碱性氧化铝SPE小柱用10mL乙腈活化,然后将全部样品提取液过柱,再用10mL乙腈将碱性氧化铝SPE小柱淋洗,将小柱用洗耳球尽量吹干,用5mL流动相洗脱,收集全部洗脱液,摇匀,并过0.45μm的滤膜,溶液上机测定。1.5.3柱长和进样量色谱柱为具有C18填料的柱子(粒度为5μm),柱长250mm,内径4.6mm;进样量20μL;紫外检测器波长270nm。2回收率的检测从图2可见:磺胺嘧啶的出峰时间约为3.919min,磺胺二甲基嘧啶的出峰时间约为5.94min,磺胺间甲氧嘧啶的出峰时间约为8.18min,磺胺甲恶唑的出峰时间约为9.583min,磺胺二甲氧嘧啶的出峰时间约为18.781min,磺胺喹恶啉的出峰时间约为20.236min。从图1可见:高质量浓度标准品的峰谱图受试剂峰(杂峰)的干扰较小,而低质量浓度标准品的峰谱图受试剂峰的干扰较大。试验中之所以要检测2个不同质量浓度的6种磺胺类药品标准溶液,一是为了比较试剂峰对标准峰的干扰。二是当添加低质量浓度的试样时,用低质量浓度的标准峰面积值进行定量计算(添加量为5、10和15mg/kg),当添加高质量浓度的试样时,用高质量浓度的标准峰面积值进行定量计算(添加量为20和25mg/kg)。试样溶液的出峰时间与标准溶液的出峰时间进行比较时,最高不能超过标准品±0.2min,如果出峰时间偏离较高,应先观察被测样品的出峰时间在什么时间段,并与标准物质出峰时间的偏离有多大,再进行比较,如被测样品峰面积值高并且与标准样品出峰时间偏离较高,应考虑是否是仪器出了问题,或是仪器的C18没有充分活化等。如果被测样品峰面积值很小并且与标准样品出峰时间偏离较高,则应考虑是否为试剂杂峰或是样品杂峰(因为饲料的成分较为复杂,而且不同饲料的配方与所用原料也有较大区别)。从图3可见:空白样品虽有峰谱出现,但与标准品进行比较时,均不符合标准品的出峰时间,所以空白样品的峰谱均为试剂杂峰或样品杂峰。从图4和图5可见:添加样品的峰谱与标准品的峰谱进行比较时,符合标准品的出峰时间,证明此次检测符合加标回收规律。低质量浓度添加时受杂峰干扰较大,高质量浓度添加时受杂峰干扰较小。表1中的6种磺胺类标准品的峰面积值,是此次检测时参与结果计算的峰面积值。从表2可见:对6种磺胺类药品进行连续8次检测,磺胺嘧啶标准品离散系数(CV值)≤1.04%,磺胺二甲基嘧啶CV值≤1.35%,磺胺间甲氧嘧啶CV值≤0.94%,磺胺甲恶唑CV值≤0.79%,磺胺二甲氧嘧啶CV值≤1.07%,磺胺喹恶啉CV值≤1.37%;证明利用高效液相色谱法检测6种磺胺类药品时,仪器性能稳定,重复性好。从表3～表8可见:磺胺嘧啶不同质量浓度添加的平均回收率为90.32%～96.9%,回收率标准偏差为0.41%～0.94%;磺胺二甲基嘧啶平均回收率为87.93%～95.73%,回收率标准偏差为0.27%～0.49%;磺胺间甲氧嘧啶平均回收率为88.17%～96.19%,回收率标准偏差为0.32%～0.78%;磺胺甲恶唑平均回收率为88.73%～94.4%,回收率标准偏差为0.4%～0.72%;磺胺二甲氧嘧啶平均回收率为89.67%～94.3%,回收率标准偏差为0.21%～0.48%;磺胺喹恶啉平均回收率为88.08%～94.28%,回收率标准偏差为0.3%～0.59%;证明此方法具有回收率高,而且相同质量浓度下回收率比较稳定。当高质量浓度添加时要普遍好于低质量浓度添加的回收率,而这6种磺胺类药品中回收率最高的是磺胺嘧啶。此方法操作简单易行,单一样品的检测时间约在30min,样品的提取也不是很复杂,并且具有较好回收率与CV值,适合饲料中6种磺胺类药物的大批量检测等特点。液相