n-乙酰半胱氨酸对重症急性胰腺炎大鼠血-脑屏障及脑组织损害的保护作用

n-乙酰半胱氨酸对重症急性胰腺炎大鼠血-脑屏障及脑组织损害的保护作用

胰腺脑病（pe）是由重症急性胰腺（sap）引起的严重并发症之一。其病理依据包括血液障碍（bbb）的损伤。本研究观察抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对SAP大鼠脑组织损害及与BBB有关的3种细胞骨架蛋白表达的影响;以探讨NAC对SAP大鼠BBB及脑组织损害的保护作用。现报告如下。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物试验中心SPF级雄性SD大鼠30只,质量200～250g,由北京市动物试验中心提供;随机分成假手术组(SO组)、SAP组和NAC干预组(NAC组),每组10只大鼠。1.1.2实验用培养基NAC(北京拜尔迪公司);胶质纤维酸性蛋白(GFAP),凋亡相关基因(Bcl-2),基质金属蛋白酶-9(MMP-9)免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。1.2方法1.2.1ap模型的诱导给SAP组和NAC组大鼠从胰胆管逆行注入5%牛磺酸钠(0.1ml/100g)诱导AP模型。NAC组大鼠造模后30min腹腔注射5%NAC(0.2ml/100g),SO组大鼠自胆胰管内逆行注入生理盐水(0.2ml/100g)。1.2.2脑电he观察于术后3h、6h和12h分别将3只、3只和4只大鼠处死。取左侧大脑,经10%甲醛固定,石蜡包埋、切片,行HE染色,光镜观察;脑组织学改变采用孔雷等的脑组织病理评分法进行评分。右侧大脑于视神经交叉处作冠状位切片,取大鼠脑组织数块、制片,行透射电镜观察。1.2.3组织内皮细胞染色取左侧脑组织切片进行Bcl-2、GFAP、MMP-9免疫组化染色,操作方法严格按照试剂盒上的说明进行。细胞内出现棕褐色颗粒为阳性细胞;其中Bcl-2为神经元染色,GFAP为星形胶质细胞染色,MMP-9为血管内皮细胞染色。光镜下观察切片,随机选取每个区域不重复的10个高倍视野(10×40),分别计数Bcl-2、GFAP、MMP-9的阳性细胞数,计算其均值。1.2.4统计方法数据以均数±标准差(±s)表示,各组间均数比较采用方差分析,组间两两比较用t检验。用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。2结果2.1脑病理评分比较见表1。SO组大鼠脑组织无异常改变,病理评分为0分。SAP组和NAC组各亚组脑组织病理评分均明显高于SO组(均P<0.01);NAC组各亚组脑组织病理评分则明显低于SAP组相应亚组(均P<0.01)。2.2各组细胞组织病理结果见图1。SO组:脑神经细胞结构完整,核膜清晰、核仁存在,胞浆内线粒体无水肿、细胞器正常、细胞膜无破裂,间质无水肿、基底膜完整。SAP组:各亚组大多数细胞可见染色质边聚、核仁消失、胞浆水肿、内容减少、线粒体水肿,重者空泡样变、核膜破裂;间质水肿明显,内皮细胞也出现水肿。上述变化随时间延长而加重。NAC组:少量细胞可见染色质边聚、线粒体水肿,与SAP组比较,大多数细胞损害轻,间质水肿也较轻。2.3血压bcl-2见图2。SO组可见Bcl-2弱表达;GFAP表达较少,染色较均匀,结构完整。SAP组和NAC组Bcl-2表达随时间延长逐渐增高;随时间延长可见星形胶质细胞增生明显。NAC组MMP-9阳性表达的血管内皮细胞被染成棕色,随时间延长表达明显增强。2.4对脑胶质瘤大鼠体内bcl-2、gfap阳性细胞数表达的影响见表2～4。SAP组和NAC组各时间点脑组织Bcl-2、GFAP、MMP-9阳性细胞数均明显高于SO组(均P<0.01)。NAC组各时间点脑组织Bcl-2、GFAP阳性细胞数均明显高于SAP组(均P<0.01),MMP-9阳性细胞数明显低于SAP组(均P<0.01)。随着手术后时间的延长,SAP组和NAC组脑组织Bcl-2、GFAP、MMP-9阳性细胞数均明显逐步升高。3对产品的诱导与保护细胞的作用BBB是以脑毛细血管内皮细胞间的紧密连接为主的特殊结构,外有星形胶质细胞足突包绕其95%～99%的表面,BBB的开放将导致血管源性脑水肿和继发性脑损伤。本研究显示,SAP组光镜下可见神经细胞间质水肿,神经细胞核浓染,固缩,随时间延长可见颗粒细胞变性呈空泡样、胶质细胞增生聚集成堆。电镜下各时间组大多数细胞可见染色质边聚、核仁消失、胞浆水肿、内容减少、线粒体水肿、重者空泡样变、核膜破裂。间质水肿明显,内皮细胞也出现水肿。上述变化随时间延长而加重。这同以往的研究一致,表明PE的发生伴有明显的BBB开放。BBB是由蛋白纤维交织而成的立体网状结构,几乎参与细胞一切重要的生命活动,其改变涉及细胞骨架蛋白的降解。本研究所选取的3种细胞骨架蛋白是与BBB密切相关的。其中,GFAP是特异性存在于星形胶质细胞中,其表达程度与星形细胞活性成正比。Bcl-2基因是与缺血性脑损伤后细胞凋亡关系最密切的凋亡调控基因。研究显示,Bcl-2在缺血前有少量表达,缺血再灌注时表达迅速上调,从而抑制部分细胞凋亡的发生,可防止或减少脑缺血再灌注损伤,从而诱导细胞凋亡。MMP-9是基质金属蛋白酶类(MMPs)的家族成员之一,其底物主要包括明胶、弹性蛋白、Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原和粘结蛋白等,这些构成的基底膜是BBB的主要成分。有证据表明,活化的MMP-9通过对富含基底膜的毛细血管床过度降解而使BBB开放,炎症细胞和因子浸润,也可以诱导或加重神经元的凋亡。NAC是一种新型抗氧化剂,能够抑制白细胞的呼吸爆发及肿瘤坏死因子-α的释放和作用,具有清除自由基和保护细胞作用。秦文等研究显示,NAC可以改善再灌注损伤引起的大鼠脑皮质星形胶质细胞能量代谢障碍的状况,通过抗氧化途径对缺血性脑损伤发挥神经保护作用。也有研究表明,NAC可有效促进凋亡调控基因Bcl-2的表达,从而使缺血再灌注的脑组织损伤减轻。本研究显示,SAP后3h,即可见到内皮细胞的胞饮小泡逐渐增多,BBB部分破坏,导致细胞毒性脑水肿。至12h时内皮细胞间的紧密连接明显开放,不仅使大量水、电解质外流,也使大量蛋白质外流,造成血管源性水肿。而应用NAC后,上述水肿改变明显减轻,脑组织病理评分减少。提示NAC对于减轻脑水肿、保护脑组织细胞、减少PE死亡率有明确作用。免疫组化染色显示,SO组Bcl-2和GFAP呈弱表达,而SAP组和NAC组3种细胞骨架蛋白均有表达,并随时间延长表达明显。给予抗氧化剂NAC处理后,Bcl-2表达较SAP组明显增加,表明NAC可以促进细胞凋亡基因的表达,从而减轻脑组织损伤。各时间点GFAP表达明显高于SAP组,表明随着神经元细胞骨架蛋白异常降解的同时,伴有反应性星形胶质细胞的增生。GFAP表达水平变化既是细胞组织损伤的表现,也是病变神经组织修复在分子水平的表现。提示NAC可以促进星形胶质细胞增生,从而促进脑组织损伤的修复。而MMP-9表达阳性细胞数明显低于SAP组,提示应用NAC后基底膜降解减轻,BBB开放程度降低,对缺血再灌注的脑组织损伤有保护作用。本研究发现,SAP时BBB作为维持中枢神