干眼模型的研究进展

干眼模型的研究进展

动物实验是眼科学研究的重要手段。建立合适的眼睛模型是动物实验的先决条件。目前已有多种建立干眼动物模型的方法,如通过营养因素、环境因素、毒性物质、药物作用、改变动物性激素分泌水平、去除泪腺或眼表的神经支配、诱导泪腺产生自身免疫反应及手术摘除泪腺等。常用于制作干眼模型的动物主要有兔、狗及鼠等,此外也有猫、恒河猴、貂及马等制作干眼模型的报道。本文综述几种主要的动物干眼模型的制作及特点。1干眼动物模型的制备兔眼球体积大,性格温顺,可直接观察到荧光素染色、虎红染色、Schiemer试验等各项泪液学指标的变化,是常用的干眼动物模型之一。兔的泪腺非常发达,杯状细胞密度高,加之有第三眼睑(相当于一个软性接触镜)的存在,增加了兔干眼模型制作的难度。此外,目前市场上用于抗兔的单克隆抗体极少,因此在干眼形成后要进一步进行有关的炎症因子或细胞因子的检查受到一定的限制。常用于制作干眼模型的兔为新西兰大白兔,其制作方法主要有以下几种。1.1泪液缺乏干眼模型1.1.1干眼的形成和模型的建立泪腺是泪液水液层的一个重要来源,哈氏腺有类似睑板腺及皮脂腺的作用,第三眼睑对眼表具有保护作用,因此摘除泪腺及哈氏腺,可致泪液分泌(主要是水液层)下降,并消除第三眼睑对眼表的保护作用而产生泪液缺乏型干眼。Francois等证实了这一方法的可行性。但由于兔的杯状细胞发达,加之此法没有破坏副泪腺,因而干眼的形成往往需要两个月甚至更长的时间,有时甚至不能形成明显的干眼。如果泪腺没有摘除干净,则导致干眼模型制作失败。此外,由于兔的泪腺分布范围广泛,手术损伤大,因而此模型早期泪膜的质量受手术干扰较大。Gibard等对上述方法做了一定的改进。他不摘除泪腺,而是采用一种纤细的探针插入泪腺导管的开口对其进行灼烙,使得泪腺导管封闭,泪液不能排出。此法减少了手术对眼表的刺激与干扰,其效果与泪腺摘除相似,但寻找泪腺导管开口存在一定的困难。国内谢汉平等在摘除泪腺、哈氏腺及第三眼睑的基础上,加用50%的三氯醋酸对结膜表面进行烧灼以破坏副泪腺及杯状细胞,使得干眼更容易产生,且程度更为严重。但此法早期对眼表的干扰更大,如操作不当,可引起角膜溃疡甚至穿孔。如果要进行有关促进杯状细胞生长的药物疗效的观察,使用的三氯醋酸浓度过高或烧灼的时间过长,有可能导致杯状细胞彻底受损而观察不到此类药物的治疗效果。也有单纯摘除泪腺而不摘除哈氏腺及第三眼睑制作泪液缺乏型干眼模型的报道,但其成功率更低。1.1.2阿托品滴眼药物在兔干眼模型中的应用泪腺受副交感神经支配,副交感神经的兴奋可以引起泪液分泌增加,而副交感神经受体阻断剂则可导致泪液分泌的明显下降。阿托品是一种常见的副交感神经受体阻断剂。Caruso等的研究发现,肌内注射阿托品(1.0mg/kg)可以产生兔干眼模型,但易产生全身副作用,使模型成功的几率不高。Susi等制成1%的阿托品滴眼液局部滴眼可以很快产生荧光素染色、虎红染色及Schiemer试验下降等干眼体征,但作者仅观察了6d。我们采用同样的方法对此干眼模型进行35d的观察,发现用药后1周左右干眼体征最为明显。随着时间的延长,其干眼的表现呈逐渐减轻趋势,说明这种干眼模型不能长时间维持在一个理想的状态。而且整个实验过程中,印迹细胞学检查杯状细胞密度均未出现明显的下降,角膜、结膜及眼睑病理切片检查也未见异常,提示局部滴用阿托品滴眼液短期内难以引起明显的兔眼眼表上皮细胞的损害。因而这种干眼模型不适宜于长期实验观察的研究。1.1.3压增大,杯状细胞密度下降Gilbard利用射频探针插入兔三叉神经节,去除兔眼表的神经支配,发现泪液分泌量出现明显下降,泪液渗透压增高,杯状细胞密度下降,表现出明显的干眼改变。其原理可能为:泪腺、眼表成分和它们之间的神经支配构成一个完整的功能单位,其中任何一个环节受到损害,则用以维持正常眼表结构的泪膜将受到影响。此方法的一个缺点是要准确定位到三叉神经节具有一定的困难,此外,如果操作时温度控制不当,有可能同时破坏三叉神经中的运动支。1.1.4侧.侧汗腺的免疫作用Guo等将兔一眼的泪腺摘除,用其自身淋巴细胞液培养5d后,将培养的泪腺淋巴混合细胞液注射至对侧泪腺,以诱导对侧泪腺组织产生自身免疫,从而产生类似Sjögren综合征的干眼模型。这种方法操作较为复杂,且双侧泪腺同时受损,不利于作自身对照。1.2过度蒸发的干眼模型1.2.1可逆性亲水性干眼的联合应用睑板腺分泌的脂质是泪膜的最外层——脂质层的主要来源。睑板腺功能障碍可以导致泪膜脂质层缺乏,使泪膜的破裂时间明显缩短,泪液的蒸发率明显增加,并引起泪液的渗透压增加,造成眼表损害。此外,脂质层异常还可以引起泪液清除障碍,使得泪液中的有毒物质增加,最终导致干眼的发生。Gilbard等用纤细的电刀插入兔睑板腺开口逐个进行灼烙(每个开口灼烙时间约1s),导致睑板腺开口阻塞,睑板腺脂质不能正常排出,引起泪膜脂质层异常,从而产生干眼。作者进行52周的观察,发现此法成功率较高,许多兔在术后第6周左右出现明显而稳定的干眼表现,而且技术要求低,需要的器械简单。但因为需要将电刀逐个插入睑板腺开口,因而操作费时。我们对Gilbard的方法进行改进:采用手术用烧灼器直接烧灼睑板腺开口,使操作更简便快速。我们发现采用此法在术后第4周左右就可出现明显的虎红染色及角膜荧光素染色等干眼体征。这可能与烧灼器温度高,烧灼面大,使得睑板腺破坏得更为彻底及局部炎症反应更为严重等因素有关。由于采用烧灼器直接烧灼睑板腺开口对睑板的损伤较大,早期(2周内)局部的炎症反应较重,因而对眼表上皮会产生一定的损害,对泪膜的稳定性也有较大影响。上述两种封闭睑板腺开口制作干眼模型的方法虽然具有快速可靠的优点,但可导致睑板腺功能不可逆损害,与临床上许多睑板腺功能障碍干眼(通常为可逆)存在较大的差别,不适于观察对睑板腺功能有影响的药物的疗效。Jester等通过局部滴用肾上腺素建立了与临床类似的可逆性睑板腺功能障碍干眼模型。发现兔眼滴用肾上腺素后,睑板腺导管可出现过度角化,造成导管开口狭窄或阻塞,睑板腺分泌物排出障碍及分泌成分异常,从而产生睑板腺功能障碍。此外,还有局部滴用异维甲酸或对眼睑局部采用放射线进行照射的方法,也可得到类似的结果。但制作睑板腺功能障碍干眼模型往往需要很长的时间(约半年以上),而且成功率较低(有时成功率还不到40%)。1.2.2机械上提取的眼晶体产生了过度蒸发的干眼模型Fujihara发现,机械性(开睑器)上提兔眼睑1~3h可快速产生干眼,但因干眼维持时间短,因而不适宜用于进行长期实验观察研究。1.3由于维生素a的缺乏给予维生素A缺乏饮食饲养新西兰大白兔4~6个月,可以产生上皮性角膜结膜干燥模型。2鼠的脑胶囊模型鼠价格便宜,抗鼠的单克隆抗体定购十分容易,因此,在干眼研究中,鼠也是常用的实验动物。由于鼠的眼球较小,有关泪液学的检查不如兔方便,而且一些模型需要特殊的技术才能得到。常用的鼠干眼模型主要有以下几种。2.1建立nfs/sld突变鼠干眼模型摘除鼠的泪腺可以产生泪液缺乏型干眼模型,但由于鼠眼体积小,手术操作具有一定的难度,同时应注意手术对眼表的干扰。采用杂交技术得到的新西兰黑/白(NZB/NZW)F1杂交鼠,随着年龄的增长,其泪腺组织中可产生明显的自身免疫反应,表现出类似Sjögren综合征的改变。通过基因突变技术得到的NFS/sld突变鼠,出生后3d摘除其胸腺,可得到原发性Sjögren综合征模型。Waterhouse等将鼠一侧的泪腺摘除匀浆后,加入佐剂进行处理,然后回注入leiwns鼠的体内,可以诱导泪腺、唾液腺等自身免疫反应,产生类似Sjögren综合征的干眼模型。但由于回注的泪腺匀浆抗原性不高,因而成功率低(仅17%)。Sammy等对匀浆的泪腺组织加入百日咳杆菌进行进一步处理,可增强其抗原性,诱导更严重的泪腺、唾液腺自身免疫反应,使Sjögren综合征干眼模型的几率明显增高。此外,泪液缺乏型干眼模型还可通过转基因技术或基因敲除的办法,改变鼠的性激素分泌而获得。药物及环境是干眼形成的重要因素,在鼠干眼模型制造中,这些因素也得到充分的利用。Dursun等给SD鼠局部皮下注射东莨菪碱抑制鼠泪液的产生,同时将这些鼠放置在一鼓风装置制造的干燥环境中,发现可以较快地产生干眼模型。2.2治疗嘴唇需要增加数据一些特殊类型的鼠本身就存在睑板腺发育障碍的因素。Rhino鼠出生后不久,由于存在上皮变异及发育异常,睑板腺导管上皮会出现增厚及过度角化,从而产生睑板腺功能障碍。给鼠注射人单克隆抗DNA抗体,可以产生慢性睑缘炎,并可使睑板腺过度增生,睑板腺中炎症细胞浸润,也可导致睑板腺功能障碍产生。3抗炎药物模型跟兔一样,狗的眼球体积较大,容易观察到干眼体征,因而是常用干眼动物之一。狗干眼模型的最大优势在于,正常狗的泪腺中即存在自身免疫性炎症反应,