如何进行完整的靶向代谢组方法开发

E内引：1阳弗METVWVRE迈维代谢METVWVRE迈维代谢METVWVRE迈雄代谢METVWVRE迈雄代谢靶向代谢组学属于代谢组学的一个分支，代谢组学和基因组学、蛋白组学等共同组成系统生物学大家庭，如下图：从代谢组学的角度，靶向代谢组开发是基于广靶分析的再次验证，也就是对生物机体中广泛筛查后的物质成分，给出准确的定量分析结果。主要针对生物机体中分子量小于1000的特定物质或特定类型的成分，包含机体各种代谢途径下的中间产物、底物和或相关标志物，比较常见的类型如氨基酸、核苷酸、糖类、脂肪酸、胆汁酸、氧化脂质等等。靶向代谢组方法开发常用的有绝对定量和相对定量，其区别在于绝对定量需配制不同梯度的已知浓度标准品，绘制标准曲线计算出准确的含量，而相对定量则无需提供标准曲线及计算准确含量，仅提供目标成分的响应即可。如何建立科学的靶向代谢组学分析方法？

—般而言完整的靶向方法开发包含文献调研样品前处理开发仪器方法开发，方法学验证等环节。下面以基于质谱分析建立靶向代谢方法学开发进行说明。—、文献调研查阅国内外学术期刊，分析样品处理方法、检测方法、定量限等，核心的目标是确定方法开发的可行性并给出实验方案。后续的开发过程，都基于文献调研的结果。首先确定样本的类型和待分析物的类别。每种类别都有各自的理化性质和特点。其次，文献查询的关键词要准确规范，目的就是为了保证文献查询的精准、全面。文献搜索的范围，包括中英文期刊论文、国家标准或行业标准、相关专利等。如下图显示的是常用的几个搜索工具或数据库：图1：知网查询JlLSrft扁出住■立M计厨可良11担忻fFS览输捐臧聲晦1厂轶质肛価谐製*瀚I图2：SCI-HUB查询图3：PubMed查询led■_■!:■NcCK?"siLzrarPMel^.PubMeiSearchresultsled■_■!:■NcCK?"siLzrarPMel^.PubMeiSearchresultsCHfS门RcrnGTAfCustcsmEEIhfDS^Ito2D43511Ker!AdvareEd关联结果Pa®1Nex：-_as:•rubk'edFrseLillladtfirhwtDMethod油SdBiiofienccissic-aio-ibiiwiiasccthenevrhppdhhlMorQYRSCrlinrfct.p&tUN1v/ak-ra-ftdpad的Miluslirq甘QuEChERS-b^acdandLC«S.MSWangT,SunRZhangX,WangL.Guq弭B&iF拭、Wa-igJEmbiMDI曰wPiSaf2C13■■\jj29,'34.1095631曲1D.IO1G>;汕Mj口曲咼Pubiieaiiw曲r阴"'VEIN'S1D^eart加伽：羽魅PMffl:3U7S565SjmillfarLtfesAnEnBicm^fsija.euvg二xp比y-hemui1；compflnen.pnerna-zcKnsl-Kbof^rrtel丨仁巴由匚和巴SflftCtoihuriA盅OiJwAncmata2.uicGc^ndeitL-Qfs^rdcrCsADp<ic.3tc-r川Ge：s&rriumezansejeUs::sYangK.Lon^iXTvlCaoJJ.LI¥J.WutBen扎SunZLLiuZY.j叭！thewiejn临iPiaALg山冲口口ioiQia.jjp-上亂汙甬■召堺瑜巧申/辭［.-|PMH）环可工炖'72」SiTiiarartclfrs图4：国家标准查询METVWVREIBMETVWVREIB维代谢METVWVRE迈维代谢METVWVRE迈维代谢除此之外/还有百度学术/谷歌学术‘Webofscience‘chemspider‘pubchem等网上资源，相关的文献资料也很多。文献筛选也需要考虑其权威性‘同时关注相关领域最权威的实验室和最新的研究文章。二、样品前处理开发由于生物样品的基质复杂‘待分析物的含量较低（一般为ng/L或pg/L），因此对方法的灵敏度和精密度有着更高的要求‘那么样品前处理就显得尤为重要。通常‘前处理优化包含取样量、提取溶剂、提取方式、样品净化或浓缩等。取样量根据样本特性选择‘也根据待分析目标确定‘血浆、组织、细胞、尿液等都有常规的取样原则。提取溶剂的选择主要依据物质的理化信息‘可以综合各种文献的结果进行确认‘同时需要明确并注意的是样品提取环节‘是否需要避光？是否需要低温环境？是否需要增加稳定剂（如抗氧化、调节酸碱度）？等等。如果目标物在样品含量极低‘或目标物受基质干扰较大‘需要考虑样品的富集或纯化‘常见的方法如溶剂萃取、过固相萃取小柱、大孔树脂纯化、脱脂处理等‘具体方案依照文献查询的结果综合考虑。有时为了提高待分析物的可检测性，可考虑衍生化处理。如用GC-MS方法开发糖类成分、脂肪酸类成分时，就需要考虑采用衍生化试剂处理。样品前处理方案，是要在保证提取完全的基础上，避免目标物的降解、转化，降低基质干扰，以提高方法的灵敏度。但对于大批量样品的分析，前处理方法还需要考虑过程的简单，避免过多的试剂和提取过程引入的误差。下图所示为常见的几种前处理方法。三、检测方法开发检测方法开发和样品前处理开发是紧密相关的环节，这里以LC-MS/MS为例进行说明（注:LC-MS/MS是代谢组研究中最为常用的方法），主要分两个部分：一是色谱方法，二是质谱方法。1•色谱方法开发首先需要决定的是色谱柱类型。常用的是C18色谱柱，特定类型的成分，可以选择其他极性色谱柱如氨基柱、氰基柱、糖柱等，具体可以参照相关专业书籍进行选择。其次需要确定流动相和梯度体系，流动相的选择和待分析物酸碱性相关。一般而言，酸类成分，流动相中添加乙酸、甲酸等，可以改善拖尾；碱性成分，主要添加氨水等；对酸碱敏感的目标物，一般在流动相中添加缓冲盐。梯度的选择也根据目标物性质进行开发。文献资料中的方法不能完全照搬，在实际开发的过程中需要进行优化，因为色谱柱品牌不同、仪器性能不同，流出曲线是有差异的，需要根据实验情况选择最为合理的方案，保证待测目标成分和干扰物相互分离，保证较好的响应，以及调整流动相比例优化最佳的出峰时间。需要特别注意的是，HPLC方法中的流动相并不是都能直接转移到质谱端，难挥发或不能挥发的缓冲盐进入质谱后，容易在离子源处形成结晶体，甚至损坏质谱硬件。如果采用UPLC方法代替HPLC方法，色谱柱、流动相、流速、进样量都应该相应调整。METVWVRE迈维代谢METVWVRE迈维代谢METVMVRE迈雄代谢METVMVRE迈雄代谢泵溶剂僦动相进样器色谱柱（固定相）泵溶剂僦动相进样器色谱柱（固定相）2.质谱方法开发质谱开发多针对的是三重四级杆质谱，这里涉及到母离子Q1的确认和碎片离子Q3等信息，所以一般而言，质谱方法开发的第一步是建立标准品的质谱方法，通常可通过针泵进样的方式确定离子对信息和检测参数。例如分析样品中维拉帕米，在文献查阅环节，已明确目标物的分子式、结构式溶解性。见下图N.0维拉帕米：C27H38N2O4离子的质荷比，m/zN.0维拉帕米：C27H38N2O4离子的质荷比，m/z1」祐7"=4SSJDa图片来自ABSCIEX）通过针泵直接进样（大致1ppm浓度），在Q1环节，确定找到标准品的母离子。这里要特别注意的是，母离子有很多加合形式，如M+H、M-Cl、M-Na等，所以在判断母离子时，不能仅依照物质的摩尔分子量，还需要考虑目标物的电离特性。在对母离子响应不确定的时候，可以增加梯度浓度的标准品，观察峰面积是否等比例增加。找到母离子后，需通过调节碰撞能CE，确定碎片离子，即子离子。为了提高子离子的响应，需进一步对碰撞能CE和去簇电压DP等参数进行优化。碰撞能CE不同，碎片的相对丰度不同，根据最大响应值，选择最佳的碰撞能。去簇电压DP是为了消除溶剂离子簇，DP越大，去簇效果越好，DP太大会造成离子源内裂解。XTCcfXLCof样XPC-Dfl-EArgR-^CEXTCcfXLCof样XPC-Dfl-EArgR-^CE找出晟隹CE帰SflO"r!E1对匚b5(PPHJlAWPjCE)JWPjuEYF対商)D3Prom5(WJMJiJWjCEj誓氓(Tvfe5&即｝斗55.呂DOJI5ft】吨DaFranSvrpte£tbFMja/.KFjCE)&ViRPjLrr*;*f仃阮丈羽即)4S5.anj'2H>.300DiFromSwrpfe占,MRH严MFjCE：!oFW.TubgxfF(Twtc申（图片来自ABSCIEX）质谱参数的选择还有很多，可以根据实际情况调整，不同的仪器有不同的最佳参数，主要目的是保证待分析物有最佳的响应值。离子对的选择一般至少2组，一组作为定量离子，一组作为定性离子。标准品开发环节，还涉及内标物质的确定，一般而言，最好的内标物是同位素内标，与标准品有相同的色谱行为，相同的基质效应，可以更为准确的实现目标物的绝对定量。标准品开发完成后，可以进行实际样品的预实验，确定样品中目标物的大致范围，优化色谱梯度比例，根据响应值调整进样量、进样浓度等信息，同时观察是否有基质干扰，是否需要进一步纯化等等。四、方法学验证（仅针对绝对定量方法）任何方法的开发和应用，都需要一个评价标准，或是一个指导原则，来确定方法的可行性和准确性。质谱分析多涉及生物样品，药典附录中《生物样品定量分析方法验证指导原则》便是一个重要方法学验证参照。这里面定义了方法学考察的要求，也规定了质控指标。要提交完整的开发方案，方法学验证中至少应该涉及：标准曲线（线性关系）、检出限和定量限、回收率、日内日间精密度等。METVWVRE迈维代谢METVWVRE迈维代谢METVWVRE迈维代谢METVWVRE迈维代谢标准曲线需要尽量涵盖待测样品的含量区间，一般覆盖三个数量级，并满足相关系数在合理的范围，如下图。建立标准曲线的同时，也需要给出定量限和检出限指标，定量限（LOQ）以10倍噪音为基准。Compoundname:RNZCcirrelatiancaefficieni:r=O.99S016,严2=0.9&7633Calibrationci^rve:1.40535*x+0.237762Rei|>onsetype：InternalStd(Ref1),Area*(ISCane./ISArea)Curvetype-;LinearOrigin；Exdude,Weighting；1*.A^istrartg;N^n^j回收率主要是考察方法的可靠性，一般达到80%-120%之间为宜，由于生物样品的复杂性，存在复杂基质干扰的情况下，待分析物质含量极低的情况下，回收率范围可以适当放宽。日内日间精密度，为均匀样品多次重复测定所得结果的一致性，在一天之内进行的精密度考察称为日内精密度；在三天之内进行的精密度考察称为日间精密度。以上是靶向代谢组方法开发的一个基本流程。实际的开发中往往更复杂，可能还涉及质控指标的建立，数学建模分析，报告输出等等。可为各医院、科研院所、医药企业等提供代谢组鉴定与分析、跨组学分析服务，帮助其对肿瘤早期标记物进行筛选，为新药研发和疾病机制的研究提供新思路。通过广泛靶向代谢组检测技术的研