超声波振荡法制备壳聚糖缩肉桂醛席夫碱

超声波振荡法制备壳聚糖缩肉桂醛席夫碱

1壳聚糖和席夫碱地壳聚糖是脱欧酰化葡萄糖多聚物甲壳素的产物。分子链由-（1-4）-2-乙酰胺-d-葡萄糖和-（1-4）-d-葡萄糖组成。壳聚糖具有良好的生物降解性、相容性、成膜特性和较强的抗菌防腐保鲜能力,并在环境保护、生物医药、食品工业和化工方面得到广泛的应用。壳聚糖仅能溶解于酸性介质中,限制了其应用范围。但其分子链上含有2位氨基、6位伯羟基和3位仲羟基等反应性官能团,能够进行修饰反应,形成各种功能性衍生物[2~5]。席夫碱具有抑菌、杀菌、抗病毒、抗肿瘤等特殊的生物活性,近年来越来越引起人们的重视。席夫碱反应一直被应用于壳聚糖的化学改性研究中。肉桂醛是一种天然醛,为无色至微黄色油状液体,具有很好的抑制霉菌的效果,抗菌作用力强,可有效地杀灭细菌,在香料、制药、日用化学品及食品加工等方面都有广泛应用。但肉桂醛易挥发、易氧化,不易进行保藏,而且具有强烈的刺激性香辛味,从而影响了其使用效果。因此,本文将壳聚糖与肉桂醛进行缩合反应,得到具有良好抗菌活性的壳聚糖席夫碱衍生物,并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉进行了抗菌活性研究,绘制了抑菌生长曲线,以期成为一种新型的抗菌剂。2材料和方法2.1红外光谱分析壳聚糖:脱乙酰度97%,相对分子质量1×105,青岛海汇生物工程有限公司;肉桂醛:国药集团化学试剂有限公司,AR;其它试剂:均为分析纯。AVATAR360FT-IR型红外光谱仪,KBr压片法,美国Nicolet公司;UV-2550型紫外分光光度计,日本岛津公司;PE-2400Ⅱ型元素分析仪,美国PE公司。细菌包括革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),真菌有黑曲霉(Aspergillusniger),均由中国海洋大学微生物实验室提供。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养,真菌采用沙氏培养基培养。2.2壳聚糖缩概况及其衍生物的合成将壳聚糖分散于50mL甲醇中,室温下溶胀1h,转移至250mL三口烧瓶中,并置于超声波清洗器中,开启超声波(18kHz,200W)至合成温度,恒压下缓慢滴加相应量的肉桂醛(溶于20mL无水乙醇),反应一定时间。反应结束后把所得产品进行抽滤,洗涤,得黄色粉末状固体产物。用无水乙醇在索氏抽提器上回流萃取12h,50℃下真空干燥得到壳聚糖缩肉桂醛席夫碱衍生物。缩合反应方程式为:缩合率(P%)按下式计算:其中:m1为壳聚糖的质量(g);m2为缩合衍生物的质量(g);M1为壳聚糖结构单元的摩尔质量(161g⋅mol-1);M2为缩合衍生物结构单元的摩尔质量(g⋅mol-1)。2.3壳体聚糖和席夫碱的抗菌实验2.3.1抑菌效率的测定对于细菌采用平板菌落计数法测定壳聚糖和衍生物的抑菌效率。配制不同质量分数的壳聚糖溶液和衍生物溶液(0.5%的醋酸溶液为溶剂)。分别将0.1mL细菌菌悬液和0.1mL不同浓度的样品溶液均匀涂布在培养基(25mL)平板上,空白为只加菌悬液而不加样品溶液。所有平板在37℃恒温培养箱中培养24h,取出观察各个平板上的细菌生长情况,计算抑菌效率。抑菌效率的计算:η=(N1-N2)/N1×100%对于黑曲霉采用干重法测定壳聚糖和衍生物的抑菌效率。配制不同质量分数的壳聚糖溶液和衍生物溶液(0.5%的醋酸溶液为溶剂)。分别将1mL黑曲霉菌悬液和5mL不同浓度的样品溶液添加到液体沙氏培养基(45mL)中,空白为只加菌悬液而不加样品溶液,在28℃恒温振荡培养箱中培养48h,抽滤,干燥并称重菌体干重,计算抑菌效率。抑菌效率的计算:η=[(W1-W2)/W1]×100%其中,W1和W2分别为不加样品培养液中的菌丝重和添加样品培养液中菌丝重。2.3.2细菌数量测定添加一定量的样品溶液于液体营养肉汤培养基(100mL)中,使其质量浓度为0.01%,接入浓度为107个⋅mL-10.2mL的菌悬液,在37℃恒温振荡培养,定时取样测定其吸光度值,用吸光度值的变化反映细菌数量的变化。以培养时间为横坐标,不同培养时间细菌悬浊液在620nm下的吸光度OD值为纵坐标,绘制细菌的生长曲线和相同菌种在加入壳聚糖或席夫碱后的抑菌曲线。吸光度测定空白为未接种细菌的液体营养肉汤培养基。2.3.3黑曲霉质量的测定对于霉菌采用菌体干重法,添加一定量的样品溶液于液体沙氏培养基中(45mL),使其质量浓度为0.01%,接入黑曲霉悬浮液1mL,在28℃恒温振荡培养,定时取样,用布氏漏斗抽滤,干燥并称重菌体干重。以培养时间为横坐标,不同培养时间的菌体干重为纵坐标,绘制霉菌的生长曲线和相同菌种在加入壳聚糖或席夫碱后的抑菌曲线。3结果与讨论3.1壳聚糖的结构表征和衍生物的x-射线衍射采用美国系列傅里叶型红外光谱仪,利用KBr压片法测定壳聚糖及其衍生物的红外光谱。壳聚糖和壳聚糖缩肉桂醛席夫碱的红外吸收光谱如图1所示。从图1中可知,壳聚糖红外谱图中1597.2cm-1处为氨基N-H变形振动峰,2875.7cm-1处为C-H伸缩振动吸收峰,3417.7cm-1处归属于壳聚糖分子中O-H伸缩振动和N-H伸缩振动的吸收峰,1082.4cm-1处为C-OH的吸收峰;衍生物在1633.9cm-1出现C=N伸缩振动峰;1491.4cm-1和1449.5cm-1处是苯环上骨架振动峰;750.1cm-1和689.2cm-1处是单取代苯环的C-C伸缩振动峰;3051.99cm-1是衍生物中不饱和双键=C-H伸缩振动峰。说明壳聚糖上的氨基与含醛基的肉桂醛发生了缩合反应,生成了碳氮双键和引入了苯环。图2为壳聚糖和壳聚糖缩肉桂醛席夫碱的X-射线衍射谱图,从图中可知,壳聚糖是一种结晶性高分子,在衍射角2θ为10°和20°附近出现强衍射峰。用肉桂醛缩合改性后形成的席夫碱,在位于2θ=10°的结晶衍射峰几乎消失,2θ=20°附近衍射峰明显减弱,说明壳聚糖发生了化学改性,与肉桂醛发生了缩合反应。3.2正交实验结果采用正交实验法[L9(33)]研究各因素分别对席夫碱反应缩合率和取代度的影响,以得到最佳反应条件,取代度由元素分析数据计算得到。正交实验方案及结果见表1~表3。由表中结果可知,三个因素对缩合率和取代度的影响作用大小顺序皆为:反应物配比>反应时间>反应温度。欲使缩合率和取代度最大,宜采用反应物配比n(壳聚糖):n(肉桂醛)=1:6,反应温度40℃,反应时间8h。在最优化条件下,进行优化条件重复实验,缩合率可达89.38%,取代度为0.84。3.3壳体聚糖和席夫碱的抗菌实验3.3.1壳聚糖和产生解决分离的药物对大肠杆菌和嫌犯的最低抑菌浓度是由认识的不同质量浓度的壳聚糖、肉桂醛和壳聚糖缩肉桂醛席夫碱的抑菌效率见表4~表6。从表4和表5中可以看出,壳聚糖、肉桂醛和壳聚糖缩肉桂醛席夫碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑制作用,且抑菌效率都随着浓度的增加而逐渐增强。壳聚糖和肉桂醛对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为0.25%和0.5%。壳聚糖席夫碱对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.08%;对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.1%。由此说明壳聚糖缩肉桂醛席夫碱的抑菌效果明显强于壳聚糖和肉桂醛。壳聚糖对黑曲霉没有明显的抑制作用,而壳聚糖缩肉桂醛席夫碱在浓度为0.5%时能对黑曲霉起到100%的抑制作用,说明壳聚糖分子链上的氨基与肉桂醛发生缩合后,增强了壳聚糖的抑菌活性,扩大了抑菌范围。3.3.2壳聚糖缩产生内乳酸钠的抑菌效果图3、图4和图5分别为壳聚糖和壳聚糖缩肉桂醛席夫碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉生长曲线的影响。图中的生长曲线是在2.3.2节所述的条件下作出的。从图3中可知壳聚糖和壳聚糖缩肉桂醛席夫碱的存在显著地抑制了大肠杆菌的生长。大肠杆菌在培养4h后便开始繁殖,吸光度增大,当添加壳聚糖后,生长适应期延长为8h;当添加壳聚糖缩肉桂醛席夫碱后,40h内培养基中的菌生长被抑制在一个较低水平,起到了很好的抑菌效果。表明壳聚糖和壳聚糖缩肉桂醛席夫碱对大肠杆菌的生长均具有抑制作用,且壳聚糖缩肉桂醛席夫碱的抑菌效果明显优于壳聚糖。图4为壳聚糖和壳聚糖缩肉桂醛席夫碱对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响,结果发现两者的存在也可有效地延长金黄色葡萄球菌的生长适应期。金黄色葡萄球菌在培养4h后便开始繁殖,吸光度增大,当添加壳聚糖后,生长适应期延长为8h;当添加壳聚糖缩肉桂醛席夫碱后,生长适应期延长为12h。表明壳聚糖和壳聚糖席夫碱对金黄色葡萄球菌的生长均具有抑制作用,且壳聚糖缩肉桂醛席夫碱的抑菌效果优于壳聚糖。3.3.3壳聚糖的抗菌作用壳聚糖对黑曲霉不仅没有抑制作用,反而有助于其生长。原因可能是黑曲霉属于真菌类,真菌的细胞壁含有壳聚糖,而黑曲霉中就有较高的壳聚糖含量,使得黑曲霉对壳聚糖的抗菌性能有一定的抗性,决定了壳聚糖对黑曲霉没有抑制能力,反而可能用于促进细胞的生长和繁殖。添加壳聚糖缩肉桂醛席夫碱后,黑曲霉的菌体干重比对照组有所减少,说明衍生物可以有效地抑制黑曲霉的生长,扩大了壳聚糖的抑菌范围。壳聚糖不仅具有天然抗菌性能,而且抗菌谱广。目前壳聚糖的抗菌作用存在若干不同的机理,而且其抗菌机制也因菌种的不同而不同。对于革兰氏阴性菌,主要是壳聚糖渗透进入到微生物细胞内,吸附细胞内带负电荷的细胞质,引起其絮凝,扰乱细胞正常的生理活动,从而影响细菌生长发育,甚至杀灭细菌。对于革兰氏阳性菌,主要是由于壳聚糖吸附在微生物细胞的表面,形成一层高分子膜,阻止了物质通过细胞膜进行内外运输,导致细菌死亡。本文利用壳聚糖的抗菌活性,在其分子链上引入肉桂醛而形成席夫碱结构,制得抗菌活性优于壳聚糖的席夫碱衍生物