超声波振荡法制备壳聚糖缩柠檬醛席夫碱

超声波振荡法制备壳聚糖缩柠檬醛席夫碱

壳聚糖是迄今为止发现的唯一天然碱性糖，具有良好的生物降解性、适应性、成膜特性和较强的抗菌、耐候性等特点，但只能溶解在酸性介质中，且不能限制其应用范围。席夫碱具有抑菌、杀菌、抗病毒、抗肿瘤等特殊的生物活性,近年来越来越引起人们的重视。席夫碱反应一直被应用于壳聚糖的化学改性研究中。柠檬醛具有杀驱昆虫、防腐和抑杀真菌、霉菌作用,对多种真菌的抗菌效力与公认较好的合成食用防腐剂山梨酸钾相近,明显优于苯甲酸钠,而且柠檬醛的抗菌活性pH值范围较宽广,不仅对酸性食品有效,对中性食品也有效。柠檬醛具有浓郁的柠檬果香味,不仅是很好的食品增香剂,而且还可以作为食品的良好防腐保鲜剂。壳聚糖与柠檬醛进行席夫碱化反应制备出壳聚糖席夫碱衍生物,并对其进行抗菌作用的研究还未见报道。本文作者将壳聚糖与抗菌活性范围较广的柠檬醛进行缩合反应,得到具有良好抗菌活性的壳聚糖席夫碱衍生物,并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉进行了抗菌活性研究,绘制了抑菌生长曲线。1实验部分1.1缩合率的计算壳聚糖,脱乙酰度97%,相对分子质量1.0×105,青岛海汇生物工程有限公司;柠檬醛,上海埃彼化学试剂厂,分析纯;其它试剂均为分析纯。缩合率(P)按式(1)计算。式中,m1为壳聚糖的质量,g;m2为缩合产物的质量,g;M1为壳聚糖结构单元的摩尔质量(采用的壳聚糖脱乙酰度为97%,可按近似处理不考虑3%的乙酰基团),161g/mol;M2为缩合产物结构单元的摩尔质量,g/mol。1.3壳体聚糖和席夫碱的抗菌实验1.3.1材料、仪器和抑菌效率对于细菌采用平板菌落计数法测定壳聚糖和席夫碱的抑菌效率。配制不同质量分数的壳聚糖溶液和席夫碱溶液(0.5%的乙酸溶液为溶剂)。分别将0.1mL菌悬液和0.1mL不同浓度的样品溶液均匀涂布在培养基平板上,空白为只加菌悬液而不加样品溶液。所有平板在37℃恒温培养箱中培养24h,取出观察各个平板上的细菌生长情况,计算抑菌效率。Avatar360FTIR型红外光谱仪,KBr压片法,美国Nicolet公司;UV-2550型紫外分光光度计,日本岛津公司;PE-2400Ⅱ型元素分析仪,美国PE公司;D8Advance型X射线衍射仪,德国Bruker公司。细菌包括革氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)和革氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),真菌有黑曲霉(Aspergillusniger),均由中国海洋大学微生物实验室提供。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养,真菌采用沙氏培养基培养。将壳聚糖分散于50mL甲醇中溶胀1h,转移至250mL三口烧瓶中,并置于超声波清洗器中,开启超声波至合成温度,于恒压滴液漏斗中缓慢滴加相应量的柠檬醛(溶于20mL无水乙醇),反应一定时间。反应结束后把所得产品进行抽滤,洗涤,得黄色粉末状固体产物。用无水乙醇在索氏抽提器上回流萃取12h,50℃下真空干燥得到壳聚糖缩柠檬醛席夫碱衍生物。缩合反应方程式为:抑菌效率的计算见式(2)。式中,N1和N2分别为空白平板和涂有样品的平板上的菌落数。对于黑曲霉采用干重法测定壳聚糖和席夫碱的抑菌效率。配制不同质量分数的壳聚糖溶液和席夫碱溶液(0.5%的乙酸溶液为溶剂)。分别将1mL黑曲霉菌悬液和2mL不同浓度的样品溶液添加到液体沙氏培养基中,空白为只加菌悬液而不加样品溶液,在28℃恒温振荡培养箱中培养48h,抽滤,干燥并称重菌体干重,计算抑菌效率。抑菌效率的计算见式(3)。式中,W1和W2分别为不加样品培养液中的菌丝重和添加样品培养液中菌丝重。1.3.2菌种生长曲线测定对于细菌采用比浊法,添加一定量的样品溶液于液体营养肉汤培养基中,使其质量浓度为0.1g/L,接入浓度为107cfu/mL0.2mL的菌悬液,在37℃恒温振荡培养,定时取样测定其吸光度值,用吸光度值的变化反映细菌数量的变化。以培养时间为横坐标,不同培养时间细菌悬浊液在620nm下的吸光度OD值为纵坐标,绘制细菌的生长曲线和相同菌种在加入壳聚糖或席夫碱后的抑菌曲线。吸光度测定空白为未接种细菌的液体营养肉汤培养基。1.3.3黑曲霉菌体的制备对于霉菌采用菌体干重法,添加一定量的样品溶液于液体沙氏培养基中,使其质量浓度为0.1g/L,接入黑曲霉悬浮液1mL,在28℃恒温振荡培养,定时取样,用布氏漏斗抽滤,干燥并称量菌体干重。以培养时间为横坐标,不同培养时间的菌体干重为纵坐标,绘制霉菌的生长曲线和相同菌种在加入壳聚糖或席夫碱后的抑菌曲线。2结果与讨论2.1壳聚糖的结构表征壳聚糖和壳聚糖缩柠檬醛席夫碱的红外吸收光谱如图1所示。壳聚糖红外谱图中1597.23cm-1处为氨基N—H变形振动峰,2875.72cm-1处为C—H伸缩振动吸收峰,3417.71cm-1处归属于壳聚糖分子中O—H伸缩振动和N—H伸缩振动的吸收峰,1082.40cm-1处为C—OH的吸收峰。产物在1648.30cm-1出现C=N伸缩振动吸收峰;1610.60cm-1是C=C伸缩振动吸收峰,3064.25cm-1是不饱和双键=C—H的吸收峰,1597.2cm-1处氨基N—H变形振动峰消失,可推知壳聚糖上的氨基与含醛基的柠檬醛发生了缩合反应,生成了碳氮双键。图2为壳聚糖和壳聚糖缩柠檬醛席夫碱的X射线衍射谱图,由图2可知,壳聚糖是一种结晶性高分子,在衍射角2θ为10°和20°附近出现强衍射峰。用柠檬醛缩合改性后形成的席夫碱,在位于2θ为10°时的结晶衍射峰消失,2θ为20°附近衍射峰明显减弱,说明壳聚糖发生了化学改性,与柠檬醛发生了缩合反应。2.2反应物摩尔比n壳聚糖n柠檬醛对缩合率和取代度的影响采用正交实验法[L9(33)]研究各因素对席夫碱反应缩合率和取代度的影响,以得到最佳反应条件,取代度由元素分析数据计算得到,如表1~表4所示。由表1~表4结果可知,3个因素对缩合率和取代度的影响作用大小顺序皆为:反应温度>反应物配比>反应时间。欲使缩合率和取代度最大,宜采用反应物摩尔比n(壳聚糖)∶n(柠檬醛)=1∶6,反应温度40~50℃,反应时间10h。在最优化条件下,进行优化条件重复实验,缩合率可达86%,取代度为0.82。2.3壳体聚糖和席夫碱的抗菌实验2.3.1浓度对抗菌效果的影响壳聚糖及席夫碱的抑菌效率测试见表5~表7。从表5和表6中可以看出,壳聚糖和壳聚糖缩柠檬醛席夫碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑制作用,且抗菌效果都随着浓度的增加而逐渐增强。壳聚糖缩柠檬醛席夫碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为1g/L,显著优于壳聚糖,说明壳聚糖缩柠檬醛席夫碱的抑菌效果明显强于壳聚糖。从表7中可知,壳聚糖对黑曲霉没有明显的抑制作用,而壳聚糖缩柠檬醛席夫碱在质量浓度为5.0g/L时能对黑曲霉起到100%的抑制作用,说明在壳聚糖分子链上引入柠檬醛席夫碱结构后,增强了壳聚糖的抑菌活性,扩大了抑菌范围。2.3.2壳聚糖添加量的确定图3、图4为细菌生长曲线。由图3和图4可知,壳聚糖和壳聚糖缩柠檬醛席夫碱的存在显著地抑制了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在培养4h后便开始繁殖,吸光度增大,当添加壳聚糖后,生长适应期均延长为8h;而添加壳聚糖缩柠檬醛席夫碱后,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在培养12h后才开始繁殖。表明壳聚糖和壳聚糖缩柠檬醛席夫碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均具有抑制作用,且壳聚糖缩柠檬醛席夫碱的抑菌效果优于壳聚糖。2.3.3壳聚糖的抗菌作用机制图5为霉菌生长曲线。由图5可知,壳聚糖对黑曲霉不仅没有抑制作用,反而有助于其生长。原因可能是黑曲霉属于真菌类,真菌的细胞壁含有壳聚糖,黑曲霉中就有较高的壳聚糖含量,使得黑曲霉对壳聚糖的抗菌性能有一定的抗性,这决定了壳聚糖对黑曲霉没有抑制能力,反而可能用于促进细胞的生长和繁殖。添加壳聚糖缩柠檬醛席夫碱后,黑曲霉菌体干重比对照有所减少,说明席夫碱可有效地抑制黑曲霉的生长,扩大了壳聚糖的抑菌范围。抗菌作用机制可以归纳为5种类型:(1)抑制核酸的合成;(2)抑制蛋白质的合成;(3)改变细胞膜的通透性;(4)干扰细胞壁的合成;(5)作用于能量代谢系统和作为抗代谢物。壳聚糖不仅具有天然抗菌性能,而且抗菌谱广。目前壳聚糖的抗菌作用存在若干不同的机理,其抗菌机制也因菌种的不同而不同。本研究利用壳聚糖的抗菌活性,在其分子链上引入柠檬醛席夫碱结构,制得抗菌活性优于壳聚糖的席夫碱衍生物。3n柠檬醛的制备(1)壳聚糖与柠檬醛在超声波振荡下反应