柴胡加龙骨牡蛎汤对慢性应激抑郁大鼠的抗抑郁作用

柴胡加龙骨牡蛎汤对慢性应激抑郁大鼠的抗抑郁作用

柴胡嘉隆谷煮牡蛎治疗（clsd）源于伤寒。根据小柴胡汤（xcd）的记载，它是由甘草和其他药物引起的。然后加入龙骨、牡蛎、桂枝、椰子和大黄。原书主治“伤寒八九日,下之,胸满烦惊,小便不利,谵语,一身尽重,不可转侧者”。全方寒温并用,攻补兼施,具有疏肝理气,通阳泄热,重镇安神之功,尤适用于病情错综复杂的证候。现今在临床上多用于抑郁症的治疗,被认为是最适合的古方之一。而小柴胡汤则鲜有用于抑郁症的报道。近年本实验室研究发现,柴胡加龙骨牡蛎汤对多种经典的抑郁动物模型均显示出抗抑郁作用,对抑郁大鼠脑内单胺递质具有明显的升高作用,并通过逆转HPA轴(下丘脑-垂体-肾上腺素)功能亢进发挥抗抑郁活性。为了研究柴胡加龙骨牡蛎汤全方、小柴胡汤以及非小柴胡汤部分(即龙骨、牡蛎、桂枝、茯苓、大黄)抗抑郁作用的差别,本实验采用慢性应激的方法造成大鼠抑郁模型,观察不同药物组成对慢性应激引起的动物行为的变化。1材料表面1.1不同种类植物的干酵母粉的制备柴胡加龙骨牡蛎汤中各药材(去铅丹)均购自南京市金陵大药房,并经本校中药资源学研究室秦民坚博士鉴定:人参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根;桂枝为樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝;半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎;茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核;黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根;柴胡为伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根;大黄为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.的干燥根及根茎;甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizgauralensisFisch.的干燥根及根茎;牡蛎ConchaOstreae;龙骨FossiliaOssisMastodi;姜为姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的根茎;大枣为鼠李科植物枣ZiziphusjujubeMill.的干燥成熟果实。柴胡加龙骨牡蛎汤全方、小柴胡汤和龙骨、牡蛎、桂枝、茯苓、大黄方(龙牡桂苓军)均按原方比例配方。用10倍量水煎煮两次,合并滤液蒸干,制备成浸膏冻干粉,柴胡加龙骨牡蛎汤全方、小柴胡汤、龙骨牡蛎军的得率分别为16.9%、19.8%以及12.3%。各冻干粉放于-20℃冰箱里储存备用,临用时用蒸馏水配成所需浓度。盐酸氟西汀胶囊(fluoxetinehydrochloridecapsules,FLU)为加拿大奥贝泰克制药有限公司生产,批号HD0560。1.2动物SD大鼠,♂,体重180~200g,由中国药科大学实验动物中心提供。动物分笼饲养,保持昼夜节律,室温22±1℃,食水自由。2方法2.1动物模型转化所有大鼠适应饲养7天后,用Open-Field法作行为学评分,选择得分相近的90只大鼠随机分为9组:正常组(Normal);模型组(Model);阳性药对照组(FLU,20mg/kg);柴胡加龙骨牡蛎汤高、低(500、200mg/kg)剂量组;小柴胡汤高、低(800、320mg/kg)剂量组;龙牡桂苓军高、低(200、80mg/kg)剂量组。除正常组外,其余各组均连续接受各种不同的应激以复制慢性应激抑郁模型。动物模型根据文献方法改进,每天随机选取以下应激中的任意一种:冷水游泳(4℃,5min)、热应激(45℃,5min)、禁水(24h)、禁食(24h)、夹尾(1min)、水平摇晃(60Hz,15min)和昼夜颠倒等刺激,平均每种刺激各3次,使大鼠不能预料刺激的发生,以避免发生适应性。各组每日上午8时灌胃给药,连续21d,正常组和模型组给予等量蒸馏水。各组动物于d1、d7、d14、d21称量体重。2.2行为观察指标2.2.1运动运动得分所有动物于d21灌胃后1~2h,置于安静、黑暗的箱子里进行实验。水平运动得分:大鼠置于敞箱中央格,以穿越1格为1分(四爪均进入方格才计数);垂直运动得分:两前爪腾空或攀附墙壁次数。水平活动得分反映大鼠的运动活动性水平;垂直活动得分则反映其兴趣高低。2.2.2大鼠摄食蔗糖溶液量的检测所有大鼠于实验d19起禁食水24h(期间灌胃1次),于d20予食物及1%蔗糖水溶液200mL,观测大鼠在24h内的饮用蔗糖水溶液量。比较正常组大鼠、模型组以及各给药组大鼠在糖水消耗及糖水偏爱方面的差异。糖水偏爱(SucrosePreference,SP)以蔗糖水溶液的消耗量(mL)/总液体的消耗量(mL)×100%表示。2.3各组大鼠的马匹比测量实验最后一天各组大鼠称重,股动脉取血处死,取双侧的海马,称重。取海马与大脑重量的比值,以消除各组体重差异的影响。2.4腺组织的制备实验最后一天各组大鼠称重,股动脉取血处死,剖开腹腔,把肾上腺连同周围少量脂肪组织一起摘出,浸入生理盐水中洗净附着的血液,并将残余的脂肪组织剔除干净,用滤纸吸干表面水分,迅速称重。肾上腺指数=肾上腺重量(g)×1000/大鼠体重(g)2.5统计方法数据以x¯±sx¯±s表示,组间比较采用t检验。3结果3.1动物行为指标的影响3.1.1大鼠的运动、垂直运动情况结果见表1。经过21天的不可预见性慢性应激,模型组与空白组相比较,大鼠的水平运动、垂直运动均明显减少;与模型组相比,氟西汀、柴胡加龙骨牡蛎汤(全方组)高低剂量组及龙牡桂苓军高剂量组均能明显增加大鼠的水平得分、垂直得分,高剂量小柴胡汤组的水平得分明显增加。3.1.2水消耗量测定结果见表1。模型组与空白组相比,24h糖水消耗量明显减少;柴胡加龙骨牡蛎汤高低剂量组、龙牡桂苓军高低剂量组、小柴胡汤高剂量组以及氟西汀组可显著增加24h糖水消耗量。3.2慢性应激测试大鼠海马小结果见表1。与空白组相比,模型组的海马体积明显减小(P<0.01),提示慢性应激可造成大鼠海马的缩小。氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎汤高低剂量组以及龙牡桂苓军高低剂量组能明显对抗慢性应激大鼠的海马萎缩。3.3对慢性应激大鼠脏器脏器免疫组化的影响结果见表1。模型组与空白组相比,肾上腺指数明显升高,氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎汤高低剂量组、龙牡桂苓军高低剂量组可明显降低慢性应激大鼠的肾上腺指数,龙牡桂苓军低剂量组的效果尤为明显。4慢性应激模型传统中医认为,抑郁症属郁证范畴。由情志不舒,肝气郁结,渐致五脏不和,化火、生痰、瘀阻、耗气、伤阴等而致。临床多从肝脏论治,常用柴胡剂。其中柴胡加龙骨牡蛎汤被认为是最适合于治疗抑郁症的古方之一,甚至有“抑郁状态为柴胡加龙骨牡蛎汤之证”之说。虽然柴胡加龙骨牡蛎汤是由小柴胡汤演变而来的,但是临床上鲜有用小柴胡汤原方治疗抑郁症的报道。抑郁症的病因尚未彻底阐明,目前认为慢性、低水平、长期的应激源是促进抑郁发生、加重病情的主要原因。慢性轻度不可预见性应激抑郁模型就是根据此理论依据建立,其特点就是应激因子的多变性和不可预见性,已成为国内外学者探讨抑郁症的发病机制及抗抑郁剂作用机理而广泛应用的动物模型。慢性应激模型中大鼠活动减少、快感缺失与抑郁证患者表现出的情绪低落、兴趣丧失有一定程度的相似性。海马是在众多脑区中被认为与抑郁症的关系最为密切的脑区之一。重症抑郁病人左右侧海马较之正常人显著缩小,且缩小程度与抑郁持续时间呈正相关。Rubin等研究发现,与健康者相比,抑郁患者的肾上腺皮质增生约38%,增生的程度与皮质醇的浓度有关,且随着抑郁的缓解,这种增生似乎也随着皮质醇的正常化而逐步消失。因此,本实验采用慢性应激模型,通过大鼠活动能力、糖水消耗、肾上腺指数以及海马体积的变化,考察了小柴胡汤、柴胡加龙骨牡蛎汤及龙骨牡蛎桂枝茯苓大黄的抗抑郁作用。发现龙骨牡蛎桂枝茯苓大黄与柴胡