经皮微透析技术及其在经皮给药系统研究中的应用

经皮微透析技术及其在经皮给药系统研究中的应用

微透析（md）技术是对第一学期神经生化实验室流量采样技术的发展和扩展而来的取样技术。1991年Anderson等改进了微透析探针,并考察了7名受试者对乙醇的经皮吸收情况,开始了真正意义上的经皮微透析(cutaneousmicrodialysis,CMD)技术。皮肤是人体最大且最易受影响的器官,已证实可作为局部和全身给药部位。目前已有多种透皮制剂上市,如东莨菪碱贴剂(Transderm-Scop)、用于治疗抑郁症的司来吉兰透皮贴剂(Emsam)等。经皮给药系统(transdermadrugdeliverysystem,TDDS)可较长时间维持恒定速率给药及有效血药浓度。CMD技术已广泛用于经皮吸收药物的药动学、生物利用度和生物等效性研究。本文主要介绍CMD技术及其在经皮给药系统研究中的应用。1皮肤微分析技术1.1微透析系统cmd物质经透析膜的扩散遵循Fick定律,由于取样量小,需结合灵敏的微量化学分离及检测技术和设备。常用分离方法有液相色谱法、毛细管电泳法等,检测方法有紫外-可见分光光度法、荧光分析、电化学、免疫分析、质谱法、原子吸收光谱法等。微透析系统一般由微压力泵、微量收集器、探针、灌注液及分离检测装置组成。含外源性物质(药物)的灌注液可泵入皮肤组织,待测成分可透过半透膜随透析液输出。通过测定透析液中待测物的浓度,研究组织细胞外液中物质的水平及其实时变化过程。CMD的优势有以下几点:真实反映局部皮肤药物浓度及其代谢,并解决由于体外切除皮肤所遇到的水合、变性及细菌生长等问题;取样量小,对生物体内平衡干扰小,试验结果可靠性高;可与多种分析仪器联用,实现在体分析,易于自动化;可连续跟踪一个取样点药物的转运和代谢,且同一取样区可有多个取样点;对皮肤伤害小,人体耐受性好。但也存在不足之处,如灌注液成分受限制、仅可测定探针周围组织的浓度、重现性差等。1.2皮肤组织病理学检查用于皮肤的探针主要有线形探针和同心圆探针,由输入管、半透膜构成的中空管(200~500µm,膜厚度4~10µm)和输出管3部分相连构成。半透膜应生物相容性及稳定性良好、与透析物不发生反应。膜孔截留分子量一般为20000,允许大多数溶质自由扩散,仅限制蛋白质等大分子物质通过。目前,用于经皮微透析技术主要是线形探针(图1)。探针植入皮肤的部位为真皮浅层(在真皮浅层有毛细血管网,药物渗透到真皮后能较快被吸收)或皮下组织(脂溶性药物的贮库)。探针脆而易折,必须用导管导入植入位置,一般用20MHz超声扫描定位探针,并由组织染色切片测得探针在皮肤中的真实深度。在真皮和皮下植入探针并不影响药物的透皮性、皮肤血流量,无明显身体损伤。在药学研究中,可根据研究目的将探针植入皮肤不同深度,一般植入真皮浅层主要研究药物渗透、吸收、分布,植入真皮深层和皮下组织主要研究药物降解代谢。Mathy等研究了大鼠经离子导入氟比洛芬的情况,分别在真皮浅层[皮下(398.3±15.3)µm]和皮下组织[皮下(1878±35.8)µm]植入探针,结果显示真皮浅层和皮下组织游离药物cmax分别为(8.7±0.4)和(0.5±0.1)µg/ml,提示药物的吸收主要在真皮浅层。又有报道用微透析技术考察了氟康唑在大鼠真皮浅层[皮下(383.5±118.5)µm]中的分布及盐酸普奈洛尔经电离子导入[因离子导入会导致皮肤水肿,使真皮层厚度增加,故植入深度为皮下(1.0±0.7)mm]的药动学。Zheng等报道了用微透析技术研究大鼠皮下组织中防己碱的代谢产物。1.3检测回收率的测定影响微透析试验结果有许多因素,其中最重要的参数是探针相对回收率。药物顺浓度梯度通过半透膜扩散至以一定速度流动的灌流液,由于灌流液不停流动,使得探针透析膜内外待测物质浓度不能达到完全平衡,所以最后收集的透析液中待测物质浓度与组织中的实际浓度不等,两者比值为相对回收率。常用测定方法有外推至零流速法(extrapolationtozeroflow)、零净流速法(zero-netflux)和反渗透法(retrodialysis)等,其中反渗透法应用较多。外推至零流速法系假设零流速时探针膜内外待测物质达到平衡,通过测定不同灌流速度下微透析液中待测物的浓度,以其浓度对灌流速度进行非线性回归,拟合求得零流速下浓度。零净通量法系将灌注液流速降低,使微透析系统处于平衡状态,即透析液中待测物浓度与体内浓度一致。在此状态下,将不同浓度的待测物加至灌注液中,测定透析液中物质的浓度,由此计算得回收率。反透析法系假设待测物从两个方向通过半透膜的情况是相同的,即药物在膜两侧的扩散系数相等。在灌流液中加入一定浓度的内标物(要求具有生物惰性,结构和性质,特别是扩散系数应尽可能与待测物相似),再测定透析液中内标物的浓度,由内标浓度的变化计算回收率。回收率一般会受以下因素影响。1.3.1ty式的自然生活探针的半径、长度和植入深度,所用透析膜的厚度、长度、孔径和膜材。透析膜有聚碳酸酯(2000)和聚醚砜[poly(ethylenesulfone),100000]两种。探针深度对相对回收率是否有影响还存在一些争议。如Müller等报道探针深度(植入真皮或皮下组织)与药物浓度有相关性。Hegemann等研究烟碱贴片的渗透行为时则未发现探针深度对真皮层中药物浓度测定有影响。在双氯芬酸促渗研究中,探针在皮下组织或真皮中测得的药物浓度也未见显著差异。1.3.2负相关研究灌流液的流速和成分会影响回收率,流速与回收率呈负相关。流速2~10µl/min,回收率保持相对恒定。灌流液与待测物质的亲和力高,会增大药物在灌流液与细胞外液的分配系数,提高回收率。1.3.3等待测试的化合物特性回收率与待测物相对分子质量呈负相关,化合物扩散速率与其水合离子的电价、表面活性、亲脂性、蛋白结合率都有一定关系。1.3.4含无定形基质组织结构是药物在体内吸收主要的限速因素,细胞外液含有糖蛋白和其它大分子物质,具有凝胶性质,黏度大,可能会与膜材相互作用;真皮中含无定形基质如氨基葡聚糖、胶原纤维和弹力纤维等,都会影响药物的扩散,阻碍回收。因此,体内试验所得回收率比体外试验低。1.3.5探针植入皮肤分析方法的灵敏度会影响实验结果,根据药物的性质选择合适的检测方法。探针插入皮肤的操作,要求将导管水平植入真皮,探针通过导管后抽出导管,探针滞留皮内。实验技术人员亦存在个体差异。渗透系数也会受温度的影响。试验温度每升高1℃,药物扩散系数增加1%~2%,回收率随之增加。2使用经皮用药系统2.1药代动力学研究2.1.1皮肤透析剂的筛选在TDDS研究中,药物的通透性研究较重要,多采用体外模型(Franz扩散池)进行。但体外模型不能完全模拟体内过程。经皮微透析技术为TDDS提供了更好的研究手段,特别适于水溶性强、分子量小、蛋白结合率低等药物的研究。Simonsen等测定了14C标记的水杨酸、水杨酰胺、水杨酸丁酯和水杨酸二乙胺对裸鼠皮肤的通透性,探针植入真皮深层[皮下(0.9±0.1)mm],用反渗透法校正回收率,连续透析取样4h。测得透析液中药物浓度依序为水杨酰胺≥水杨酸丁酯>水杨酸>水杨酸二乙胺。原因是水杨酰胺的蛋白结合率最低,水杨酸丁酯(可完全水解成水杨酸)、水杨酸二乙胺和水杨酸则会与蛋白结合,浓度均较低。提示药物渗透性与分子结构有关。Leveque等用人离体腹部皮肤分别进行Franz扩散池和微透析[探针植入皮下(0.9±0.1)mm]试验,以pH2、5和7的磷酸盐缓冲液作为接受介质和透析液,监测水杨酸的透皮吸收。结果表明,随介质pH的升高水杨酸浓度下降,两种方法测得的水杨酸渗透特性相似。2.1.2皮肤长期给药对大鼠血药浓度的影响本技术可用于测定药物及其代谢产物的浓度,考察药物分布情况,借此评价最佳治疗方案。Leveque等在人体皮肤局部给予维生素C,收集的透析液由GC-MS法分析维生素C及其代谢产物浓度的变化。结果表明维生素C能快速渗透皮肤,未检测到降解产物,每间隔8h给药可维持皮肤局部较高药物浓度。Bur等用经皮微透析法检测吸烟者分别给予两种烟碱贴片(每日21mg,连续2d)后的血药浓度,考察休息及运动状态(给药8h后统一运动)对血药浓度的影响。结果表明,休息状态下两组受试者的AUC0-8h和cmax无显著差异,运动状态下AUC8-11h和cmax也无显著差异。运动状态下,组织中烟碱浓度比休息状态提高2倍。Mathy等考察了氟康唑静脉注射和局部皮下注射后在大鼠皮肤中分布,在大鼠右侧颈静脉和真皮层(皮下350µm)同时埋植探针,微透析法取样。结果表明静脉注射后,氟康唑很快渗透真皮层,且药物浓度与血浆中相近,计算得真皮-血浆分配平衡常数为1.02±0.04(n=5)。真皮层药物AUC随探针植入深度加深而增大。2.2经皮微透析技术随着TDDS迅速发展,出现了许多剂型改良的透皮制剂,其生物利用度和生物等效性考察更受关注。体外方法不能反映药物体内消除过程,由于体内有代谢酶影响,及皮肤水合程度和角质层不同,仅用体外模型研究经皮制剂所得结果不可靠。美国FDA要求剂型改良后的局部制剂,都应提供生物等效性研究数据。经皮微透析技术用于经皮给药系统研究中可考察渗透促进剂、载体、离子导入法等对制剂影响。本技术在评价局部制剂的生物等效性时至少需要20个受试者,以避免受试者个体和探针位置差异引起的偏差,置信区间在80%~125%,可说明两制剂生物等效。2.2.1不同促进剂对皮肤透析液甲氨蝶呤的影响本技术早期主要用于体内试验时渗透促进剂筛选。Matsuyama等用其考察不同浓度l-[2(decylthio)ethyl]azacyclopentan-2-one作为促渗剂时,大鼠皮肤透析液中甲氨蝶呤累积量。Murakami等研究表明,在促进剂作用下,真皮层曲尼司特(tranilast)浓度增加了400倍。Ding等研究表明,与单用油酸渗透促进剂相比,2%或5%油酸与丙二醇合用对促进盐酸昂丹司琼渗透的效果较好,且滞后时间缩短。Fang等考察了双氯芬酸水凝胶的真皮通透性,加入促进剂豆蔻油水凝胶可在真皮层透析液检测到药物,相对回收率80%~90%,结合离子导入法,有或无促进剂均能在真皮层检测到药物。2.2.2生物等效性评价近几年,经皮微透析用于人体试验的研究逐渐增多。Benfeldt等分别采用经皮微透析和胶带剥离技术(外用药施于皮肤后由于其亲脂性和扩散系数影响,会贮留角质层一段时间。在药物扩散前用胶片、胶带、胶盘等剥离角质层表面以检测药物含量的方法。)结合LC-MS法评价利多卡因乳膏及其软膏(规格均为5%)的生物等效性。结果证实两种方法均可有效用于局部制剂生物等效性评价。Kreilgaard等用经皮微透