第四章 DNA重组和基因转移

第四章DNA重组和基因转移第一节目的基因与载体的连接一粘末端DNA片段的连接（一）具有相同粘末端的DNA分子之间的连接

使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化。（二）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接

用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。

HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI对载体酶切HindIIIEcoRI对基因酶切质粒载体的定向重组二平末端DNA片段的连接1直接用T4连接酶连接2同聚物加尾法3衔接物连接法衔接物是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配，指载体与待克隆的DNA片段上的酶切位点不相同，因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘性末端。

1按照平末端连接方法加上接头2将凹端变为平端（1）使用Klenow酶在4种dNTP存在下，将3′凹端完全补平。（2）用S1核酸酶去除3′突出末端产生平端DNA分子

三载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接3使用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段部分补平3′凹端转变成粘端。载体经XhoI酶切形成：外源基因用San3A酶切形成：用Klenow酶部分补平二者的3′凹端，形成：TCGAAGCTGATCCTAGCTTCAGGA这样，就可以实现有效重组。TCGAAGCT3′3′5′5′GATCCTAG3′3′5′5′四cDNA与载体的连接通过依次加入、连接合成的DNA接头进行cDNA克隆第二节重组DNA分子的筛选与鉴定外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况：（2）（3）（1）转化E.coli一遗传检测法（一）根据载体表型特征选择重组体分子1抗药性标记插入失活筛选法例：pBR322如果外源基因插入到tetr基因内部，tetr抗性消失，表型为不抗四环素（tets）、而仍抗氨苄青霉素（ampr），这样的转化细胞在含有

amp的培养基仍可生长，但在含有四环素的培养基上不能再生长；反之，如果ampr基因由于外源基因插入其内部而失活，带有重组DNA分子的转化细胞在含有tet的培养基平板上生长，在含有

amp的培养基不能生长。

例:pUC质粒在LacZ—的大肠杆菌中，在平板培养中，菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒，其上有LacZ′，质粒和大肠杆菌DNA可实现α—互补，菌落呈蓝色。如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。

（二）根据插入序列的表型特征选择重组体

进入受体细胞的重组DNA分子中的外源基因如果在宿主细胞中能实现功能表达，产生出有功能活性的基因产物，那么鉴定此种重组体最简便的方法就是表型特征的直接选择法。

2α—互补二物理检测法凝胶电泳检测法三核酸杂交检测法

例：原位杂交筛选重组体菌落(或噬菌斑)四免疫化学检测法

免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种。标记抗体测定法的步骤：转化菌落影印平板置于含氯仿饱合气体的容器细菌裂解，抗原释放覆盖吸附有未经标记的抗体的NC膜形成抗原抗体复合物将NC膜与I125标记的抗体温育

放射自显影与母板对照，挑取所需的重组克隆

用免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因第三节基因转移方法一重组DNA导入大肠杆菌

（一）转化

将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。

为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子，我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理，处理后的细胞吸收外源DNA的能力大大提高，被称为感受态细胞。对于大肠杆菌细胞，一般采用50mmol/L的CaCl2溶液来制备感受态细胞。（1）吸附阶段：完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面（2）转入阶段：双链DNA分子解链，以单链形式进入细胞，而另一链则被降解

（3）自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环型DNA（4）表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制