木栓内酯的分离及其诱导间质干细胞增殖活性研究

木栓内酯的分离及其诱导间质干细胞增殖活性研究

云南南部的红皮书是一种生长在亚热带雨林地区的红皮书科植物。它主要分布在云南景洪、澜沧等地。20世纪90年代初，美国科学家在抗hiv-1的活性物质上发现了它。科学家们先后分离了几种化合物。这些化合物具有抗炎、抗毒、抗菌、肿瘤和其他药理活性。其中，三氟酮具有利尿作用。在对云南南部红皮书有效成分的研究中，我们以云南南部的红树皮为原料，通过萃取、柱层析和重结晶法分离出四种化合物。它们是通过1hnmr、13cnmr、r、ms和其他光谱方法获得的。然后，通过x射线衍射分析确定了它的三维结构。采用mtt法比较了这种化合物对大鼠间质干细胞的活性。1实验部分1.1分离试剂和仪器实验原料为滇南红厚壳的新鲜树叶，于2003年10月采自云南西双版纳景洪，经中科院西双版纳热带植物园陶国达高级工程师鉴定为藤黄科红厚壳属植物滇南红厚壳(CalophyllumpolyanthumWall.etChoisy);提取分离所用试剂甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯试剂;层析用0.054～0.077mm硅胶为青岛海洋化工厂生产．熔点采用北京泰克XT-4显微熔点测定仪，温度计未经校正;紫外光谱扫描采用日本岛津UV-2550紫外可见光谱仪;红外光谱测定采用美国PERKIN-ELMER公司的SPEC-TRAONEFT-IR红外光谱仪，KBr压片;核磁共振1HNMR谱和13CNMR谱采用美国VarianINONA400(1H,400MHz;13C,125MHz)核磁共振仪，CDCl3溶样，TMS为内标;质谱采用美国THERMOLCQDECAXPMAX质谱仪，测定ESI-MS;THERMODSQ测定EI;X射线单晶衍射采用德国Bruker-axsSmartAPEXⅡ单晶衍射仪．1.2柱层析提取滇南红厚壳鲜叶经风干后，称取5kg，用甲醇于室温下浸渍3次，每次20L，每次1周，合并浸提液，用旋转蒸发仪减压浓缩至干，得233g浸膏．提取浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，其中石油醚部分经浓缩至干，得50g提取物．提取物经硅胶柱(ue78840mm×600mm)层析，使用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，按50mL/瓶收集，薄层层析监控，获得萃取剂成分体积比9∶1、8∶2两个不同部位的石油醚-乙酸乙酯洗脱液．其中石油醚-乙酸乙酯(体积比9∶1)部位的第10至26号合并洗脱液，在室温下经溶剂自然挥发，得一柱状无色晶体1(250mg);剩余液继续柱层析，用石油醚-丙酮(体积比10∶1)洗脱得化合物2(120mg)．石油醚-乙酸乙酯(体积比8∶2)部位洗脱液继续柱层析，石油醚-丙酮(体积比15∶1)洗脱，得到化合物3(700mg)．乙酸乙酯萃取物经石油醚-丙酮(体积比7∶3)反复柱层析得化合物4(70mg)．化合物1～4分别采用1HNMR,13CNMR,IR,MS等谱学方法表征，并对化合物1进行X射线单晶衍射分析．1.3实验测定化合物23555.化合物1，白色针晶，m.p.246～247℃，IR(KBr压片)ν:2945,1735,1380,1070cm-1.1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:0.83,0.89,0.95,0.99,0.99,1.00,1.17(s,7×3H),1.21(d,J=6.4Hz,3H,H-23),1.91～1.94(m,2H,H-1),2.52～2.63(m,2H,H-2),4.22(q,J=6.4Hz,1H,H-4).13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:18.57(C-1),34.36(C-2),175.56(Cue5caO),84.91(C-4),69.67(C-5),38.39(C-6),18.03(C-7),42.73(C-8),38.42(C-9),63.93(C-10),35.31(C-11),30.60(C-12),39.35(C-13),40.79(C-14),32.37(C-15),35.43(C-16),29.99(C-17),52.67(C-18),35.97(C-19),28.16(C-20),32.76(C-21),39.22(C-22),13.44(C-23),16.20(C-24),17.90(C-25),38.20(C-26),20.19(C-27),32.05(C-28),31.75(C-29),35.01(C-30).EI-MSm/z(%):442(M+,15),427([M-CH3]+,7),398([M-CO2]+,28),383([M-CO2-CH3]+,15),274(24),245(28),218(44),205(54),191(36),179(19),163(24),149(26),135(28),123(42),109(64),95(100).实验数据与文献报道一致,鉴定为木栓内酯.化合物2，白色片状晶体，m.p.259～260℃，IR(KBr压片)ν:2925,2865,1715,1460,1445,1385cm-1.1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:0.74(s,3H,H-24),0.85(s,3H,H-25),0.89(s,3H,H-30),0.95(d,3H,J=6.4Hz,H-23),1.03(s,3H,H-27),1.05(s,6H,H-26,H-29),1.17(s,3H,H-28).13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:22.82(C-1),41.55(C-2),213.17(C-3),58.22(C-4),42.31(C-5),41.82(C-6),18.61(C-7),53.10(C-8),37.47(C-9),59.43(C-10),35.73(C-11),30.40(C-12),39.52(C-13),38.20(C-14),32.64(C-15),35.97(C-16),30.94(C-17),42.79(C-18),35.56(C-19),28.45(C-20),32.17(C-21),39.60(C-22),6.18(C-23),14.63(C-24),17.97(C-25),20.12(C-26),18.52(C-27),32.08(C-28),31.75(C-29),35.09(C-30).EI-MSm/z(%):426(M+,11),411([M-CH3]+,4),273(22),231(23),205(24),163(31),109(61),95(85),69(100).实验数据与文献报道一致,鉴定为木栓酮.化合物3，白色片状晶体，m.p.295～296℃，IR(KBr压片)ν:3482,2925,1465,1383,1032cm-1.1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:0.89(s,3H,H-25),0.96(s,3H,H-29),0.99(s,3H,H-26),1.01(s,3H,H-27),1.02(s,3H,H-30),1.05(d,3H,J=6.4Hz,H-23),1.06(s,3H,H-24),1.18(s,3H,H-28).13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:16.00(C-1),36.28(C-2),72.97(C-3),49.36(C-4),38.03(C-5),41.92(C-6),17.75(C-7),53.39(C-8),37.30(C-9),61.54(C-10),35.54(C-11),30.85(C-12),38.57(C-13),39.87(C-14),32.30(C-15),35.75(C-16),29.93(C-17),43.00(C-18),35.38(C-19),28.39(C-20),33.00(C-21),39.49(C-22),11.84(C-23),16.60(C-24),18.46(C-25),20.34(C-26),18.87(C-27),32.15(C-28),35.25(C-29),32.01(C-30).EI-MSm/z(%):428(M+,32),413([M-CH3]+,92),395(52),275(100),257(69),231(92),220(69),205(65),191(51),177(43),165(53),109(12).实验数据与文献报道基本一致,鉴定为木栓醇.化合物4，白色片状晶体，m.p.133～135℃，IR(KBr压片)ν:3430,2960,2935,2865,1462,1380,1059cm-1.1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:0.68(s,3H),0.83(d,J=6.4Hz,6H),0.86(d,J=6.4Hz,3H),0.93(t,J=6.4Hz,3H),1.03(s,3H),3.52(m,1H),5.35(d,J=4.8Hz,1H).EI-MSm/z(%):414(M+,28),396(18),381(10),303(18),213(20),145(22),107(29),43(100).实验数据与文献报道基本一致,鉴定为β-谷甾醇.1.4诱导小鼠骨髓间质干细胞的生长试验2木栓酯2的分离纯化化合物2～4均广泛存在于天然产物中，但化合物1还未在天然产物中发现，仅有木栓酮2在过氧化物存在下通过化学方法将其氧化成木栓内酯1的报道，但没有获得相应的单晶结构．本文首次从滇南红厚壳叶中分离出该物质的单晶，并应用于诱导小鼠骨髓间质干细胞增殖活性试验．2.1准分子离子峰化合物1的红外光谱在2945,1735,1380,1070cm-1处有较强的吸收峰．在3000cm-1以上没有吸收峰，说明化合物1中没有羟基、碳碳双键等官能团;1735cm-1为内酯羰基Cue5caO的伸缩振动吸收峰;1380cm-1为CH3的对称弯曲振动吸收峰;1070cm-1为C—O—C键的伸缩振动吸收峰．从ESI-MS得准分子离子峰[M+1]+m/z=443;从EI-MS得分子离子峰M+m/z=442．在EI-MS图谱中，m/z=427正离子是木栓内酯分子离子m/z=442丢失1个甲基产生的裂片，由于木栓内酯中有8个甲基，因此产生正离子的部位较多，导致m/z=427裂片的2次裂解方式有多种．木栓内酯分子离子m/z=442在酯基部位还可发生H转移，开环形成含羧基结构的分子离子，羧基再发生α-裂解，丢失CO2得到碎片m/z=398[M-CO2]，继续丢失1个甲基自由基，形成烯丙型正离子碎片(m/z=383)．化合物1的质谱裂解方式符合文献的裂解规律．化合物1的1HNMR谱中大部分质子信号位于高场，最具特征的是8个甲基的信号，除1个甲基为双峰信号外，另外7个为尖锐单峰信号．C-4与氧直接结合，其上的氢受邻位的CH3上的质子影响，裂分为四重峰，出现在最低场δ4.22，偶合常数J为6.5Hz，与C-23上的甲基H的J值吻合．C-2上的H与羰基直接结合，δ值在2.52～2.63．其它谱图信号的δ值均在2.0以下，为木栓内酯骨架中的CH和CH2的吸收峰，由于其δ值相近，故谱图呈现复杂的重叠峰群．2.2x-ms-l-4化合物结构表征化合物的单晶用Bruker-axsSmartAPEXⅡ单晶衍射仪(石墨单色器)测定，在298(2)K下用Ф-ω扫描方式收集衍射数据，在θ为1.62°～27.51°范围内共收集到11125个衍射点，其中独立衍射点2589个(Rint=0.0468)，可观测点2167个[I﹥2σ(I)]．化合物结构使用SHELXTL程序系统由直接法解出，对所有数据进行了全矩阵最小二乘法修正，最终偏离因子R和wR(w=1/[σ2(F02)+(0.0741P)2+0.4964P]，P=(F02+2Fc2)/3)，Flack参数为1(3)，S=1.036分别为0.0388和0.0990，所有数据由SHELXL97软件计算完成．X射线单晶衍射测定表明，化合物分子式为C30H50O2，相对分子质量M=442.70，晶体尺寸0.26mm×0.23mm×0.20mm，单晶为单斜晶系，P21空间群．晶胞参数:a=1.46378(5)nm,b=0.64546(2)nm,c=1.52635(6)nm,α=90°,β=115.010°,γ=90°,V=1.30689(8)nm3,Z=2,Dc=1.125g/cm3,λ=0.071073nm,μ(MoΚα)=0.068mm-1,F(000)=492.图2为化合物的立体透视图.X射线单晶衍射结构显示,一个木栓内酯分子由1个七元环和4个六元环稠合而成,环A、B、C呈椅式构象,环D、E呈船式构象;分子中共有9个手性碳原子.2.3木栓内酯的调控效果与木栓酮(2)比较，本文研究了木栓内酯(1)对小鼠骨髓间质干细胞增殖作用的影响，由图3可见，相同浓度的木栓内酯和木栓酮样品，木栓内酯调控小鼠骨髓