分子病理学常用研究方法-课件

分子病理学常用研究方法

(一)1分子病理学常用研究方法ppt课件分子病理学常用研究方法1分子病理学常用研究方法ppt基因变异的诊断

2分子病理学常用研究方法ppt课件基因变异的诊断2分子病理学常用研究方法ppt课件Southernblot,

PCR,

RT-PCR,Real-TimeRT-PCR,

FISH分子遗传学异常检测方法3分子病理学常用研究方法ppt课件Southernblot,分子遗传学异常检测方法3检测基因的丢失和扩增

比较基因组杂交ComparativeGenomicHybridization,CGH分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合优点：1.新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可进行CGH研究2.被测样品只需数mg甚至不到1mg的DNA4分子病理学常用研究方法ppt课件检测基因的丢失和扩增4分子病理学常用研究方法ppt课件5分子病理学常用研究方法ppt课件5分子病理学常用研究方法ppt课件CGH的应用：为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数增加，往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基因有扩增肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数减少或缺失，提示该位置可能包含已知或未知的抑癌基因丢失CGH发现MYCN，MET与胃癌相关6分子病理学常用研究方法ppt课件CGH的应用：6分子病理学常用研究方法ppt课件区分良恶性病变，临床上估计预后

16例前列腺癌CGH显示染色体异常占81%5例良性前列腺增生全部阴性

67肝细胞癌CGH显示:1q,8q,20q,17q↑4q,8p,13q,16q↓12例癌周肝硬化组织：阴性

53例淋巴结阴性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q异常，预后差

7分子病理学常用研究方法ppt课件区分良恶性病变，临床上估计预后7分子病理学常用研究方法p蛋白组学及生物芯片8分子病理学常用研究方法ppt课件蛋白组学及生物芯片8分子病理学常用研究方法ppt课件生物芯片（biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、RNA）或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量改变。

9分子病理学常用研究方法ppt课件生物芯片（biochip)9分子病理学常用研究方法ppt生物芯片：基因芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片基因芯片(Affymetrix专利）

寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因组芯片

DNAmicroarray:阵密度很高的玻片基质或胶膜基质的DNA微阵列DNAmacroarray:阵密度较低的尼龙膜DNA微阵列

10分子病理学常用研究方法ppt课件生物芯片：10分子病理学常用研究方法ppt课件杂交组织化学-概述一、概述和原理

杂交组织/细胞化学(Hybridohistochemistry)

原位分子杂交(Insituhybridization,ISH)运用核酸分子间硷基互补的性质结合免疫组织化学技术在组织切片(或细胞片)上显示特异核酸(DNA或RNA)序列的一种技术。11分子病理学常用研究方法ppt课件杂交组织化学-概述一、概述和原理11分子病理学常用研究方法杂交组织化学原理标记探针杂交变性标记探针

──

互补核酸顺序DNA/cDNADNADNA/cDNARNARNARNA12分子病理学常用研究方法ppt课件杂交组织化学原理标记探针杂交变性标记探针──互核酸分子杂交种类：固相杂交(硝酸纤维素膜或尼龙膜)Southern印迹转移(DNA)Northern印迹转移(RNA)

液相杂交原位杂交原位杂交四要素：

适当的探针良好的组织材料可靠的试剂和方法相当的形态学基础13分子病理学常用研究方法ppt课件核酸分子杂交种类：固相杂交(硝酸纤维素膜或尼龙膜)13分子二、探针的制备1.探针的种类和制备

DNA探针：应用多，操作容易比较敏感，背景高(自身网络)双链DNA探针用时要变性

整合

转化扩增DNA片段───质粒(或其他载体)───细菌───

提取酶切───质粒───探针(PCR扩增)14分子病理学常用研究方法ppt课件二、探针的制备14分子病理学常用研究方法ppt课件线性质粒提取质粒扩增探针重组质粒质粒酶切插入转染探针15分子病理学常用研究方法ppt课件线性质粒扩增探针重组质粒质粒酶切插入转染RNA探针：结合稳定，穿透性好无需变性，不存在退火问题未杂交探针可用RNase去除，背景好多采用体外转录法合成同时加以标记

寡核苷酸探针：合成快速，不用变性，对RNase不敏感30-150bp，组织通透性好未端标记，敏感度不够多采用DNA合成仪固相合成16分子病理学常用研究方法ppt课件RNA探针：结合稳定，穿透性好16分子病理学常用研究方法探针的选择:特异性多选择基因组的5'或3'端20-50对碱基互补就已稳定

大小200-300对碱基互补可获强的复合体原位杂交多选择100-400bp(<1000bp)种类稳定性：RNA-RNA>DNA-RNA>DNA-DNA17分子病理学常用研究方法ppt课件探针的选择:17分子病理学常用研究方法ppt课件2.探针的标记

标记物：同位素,非同位素,修饰物同位素：敏感，定位较差，实验室要求高

探针使用周期短

32P放射过强,定位差,半衰期短(14.3天)

35S最常用,定位好,曝光时间短(数天),半衰期较长(84天)

125I与35S相似，但半衰期较短(60天)

3H常用,放射能小,定位准确,曝光时间长(数周),半衰期长18分子病理学常用研究方法ppt课件2.探针的标记18分子病理学常用研究方法ppt课件非同位素：定位较好，实验室要求低，可长期使用

生物素：最早用，特点与免疫组化相似地高辛：最常用，敏感性高，特异性好荧光素：方法简便，敏感性低，多用于染色体检查

修饰物(现少用)：磺基化(Sulphon基团)乙酰氨基芴光敏生物素汞19分子病理学常用研究方法ppt课件非同位素：定位较好，实验室要求低，可长期使用19分子病理学常

标记方法

引入法：运用标记好的核苷酸合成探针缺口翻译法随机引物法末端标记法PCR扩增标记法RNA体外合成法化学修饰法：化学修饰已合成的探针20分子病理学常用研究方法ppt课件标记方法20分子病理学常用研究方法ppt课件缺口翻译/平移法：双链DNA标记，线环状均可分子较大(>1KB)者效果好DNA用量较多(>200ng)标记率低原理：DNA酶(DNaseI)在双链DNA分子中导入缺口DNA聚合酶(DNApolI，具有5'→3'外切酶和5'→3'聚合酶活性)，使各种核苷酸，包括标记核苷酸自缺口处合成与对应链互补的DNA链(探针)变性后标记探针分子小，穿透性好21分子病理学常用研究方法ppt课件缺口翻译/平移法：双链DNA标记，线环状均可21分子病理学常缺口翻译/平移法22分子病理学常用研究方法ppt课件缺口翻译/平移法22分子病理学常用研究方法ppt课件随机引物法：单/双链线状DNA标记，100-500bp亦可DNA用量少(可少至10ng)标记率高(1/20-25)原理：以任意顺序的六核苷酸片段为引物与单链DNA模板结合后，在DNA聚合酶I的Klenow片段(无5'-3'外切酶活性)作用下合成带标记核苷酸的互补DNA链(探针)23分子病理学常用研究方法ppt课件随机引物法：单/双链线状DNA标记，100-500bp亦可2随机引物法24分子病理学常用研究方法ppt课件随机引物法24分子病理学常用研究方法ppt课件1.于Eppendorf离心管中依次加入15μlddH2O1μgDNA(10ng-3μg)100℃10'(变性)干冰聚冷30秒钟2.加入10×六核苷酸混合物2μl10×dTNP标记混合液2μl

含1mMdATP，1mMdCTP，1mMdGTP，0.65mMdTTP，0.35mMDIG-dUTPKlenow酶(2U/μl)1μl

25分子病理学常用研究方法ppt课件1.于Eppendorf离心管中依次加入25分子病理学常用3.混合后37℃保温1-2h(可达20h)4.加入2μlpH8.0200mMEDTA终止反应5.加入2μl糖原(10mg/ml)6.加2.5μl4MLiCl或3MNaAc(pH5.5)7.加75μl无水乙醇(-20℃预冷)8.混合后-70℃30'9.13000g4℃离心15'，弃上清10.加100μl70%乙醇(预冷)洗，离心弃上清11.真空干燥，加50μlTE(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)溶解，-20℃保存

26分子病理学常用研究方法ppt课件3.混合后37℃保温1-2h(可达20h)26分子病理学常末端标记法：用于短链DNA或寡核苷酸探针标记敏感性较低40个以上碱基检测较稳定又分3'端标记法和5'端标记法3'端标记法：原理：DIG-11-ddUTP在末端脱氧核苷酸转移酶作用下与寡核苷酸的3'端相连27分子病理学常用研究方法ppt课件末端标记法：用于短链DNA或寡核苷酸探针标记27分子病理学常5'端标记法：原理:在碱性磷酸酶的作用下把5‘端磷酸脱去,T4噬菌体多核苷酸激酶将[γ-32P]ATP的γ-32P转移到5'端PCR扩增标记法：用于cDNA的合成和标记，方法简单DNA用量少，产量多原理：TaqDNA多聚酶以DNA为模板，在引物引导下合成带有标记核苷酸的cDNA探针。28分子病理学常用研究方法ppt课件5'端标记法：28分子病理学常用研究方法ppt课件PCR扩增标记法29分子病理学常用研究方法ppt课件PCR扩增标记法29分子病理学常用研究方法ppt课件1.于Eppendorf离心管中加入10×PCR缓冲液5μl(1×)MgCl22～10μl(1～5mM)引物适量(0.1～1μM)标记/非标记dNTP5μl(200μM，dTTP:Dig-dUTP=3:1)

ddH2O加到50μl模板DNA1～100ngTagDNA多聚酶0.2～1μl(1～5units)30分子病理学常用研究方法ppt课件1.于Eppendorf离心管中加入30分子病理学常用研究方反应组对照组1对照组2DNA模板++-Dig-dUTP+--2．混合后PCR仪扩增循环温度时间194°C5’94°C45’

2～3155＋0.2°C45’

72°C90’

3272°C5’

334°CHold31分子病理学常用研究方法ppt课件反应组对照组13.纯化和鉴定乙醇沉淀法：100μlPCR产物加10μl4MLiCl和300μl预冷的100%乙醇，-20˚C，2小时，离心4˚C13000g，5分钟Agarose凝胶电泳32分子病理学常用研究方法ppt课件3.纯化和鉴定32分子病理学常用研究方法ppt课件RNA体外合成/标记法：用以合成并同时标记RNA探针产量高，NTP浓度要求低，不用纯化原理：将模板DNA(双链)插入带有噬菌体RNApol启动子的特定质粒，在体外RNApol作用下，以DNA为模板、启动子为起点，合成带有标记核苷酸的RNA探针。33分子病理学常用研究方法ppt课件RNA体外合成/标记法：用以合成并同时标记RNA探针33分子杂交组织化学RNA体外合成/标记法pGEM34分子病理学常用研究方法ppt课件杂交组织化学RNA体外合成/标记法pGEM34分子病理学1.

于Eppendorf离心管中加入DNA模板(酶切成线性)1μg

含噬菌体启动子的质粒NTP标记混合物2μl

含10mMATP，10mMCTP10mMGTP，6.5mMUTP3.5mMDIG-11-UTP10×反应缓冲液2μl

DEPC处理的H2O加至17μl35分子病理学常用研究方法ppt课件1.

于Eppendorf离心管中加入35分子病理学常

2.混合后加：RNase抑制剂1μl

RNA多聚酶(SP6/T7)2μl

3.柔和混合后37℃保温2h

4.加入DNaseⅠ2μl，37℃15'(去除模板DNA)

5.加入2μl200mMpH8.0EDTA

6.加入2.5μl4MLiCl和75μl预冷乙醇

7.混合后置-70℃，30'或-20℃过夜

8.4℃13000g离心15'，弃上清

9.加100μl70%乙醇(预冷)洗，离心弃上清10.真空干燥，加100μlDEPC-H2O溶解，-20℃保存

36分子病理学常用研究方法ppt课件2.混合后加：RNase抑制剂化学修饰法：常用的有光敏生物素、磺化可用以标记单/双链DNA或RNA光敏生物素标记：光敏生物素+核酸────标记探针磺化标记：亚硫酸氢钠和甲基羟胺使胞嘧啶的C5磺化，生成Sulphon基团。乙酰氨基芴(AAF)标记：N-acetoxy-AAF与探针一起孵育时，AAF基团与鸟嘌呤核苷残基共价结合37分子病理学常用研究方法ppt课件化学修饰法：常用的有光敏生物素、磺化37分子病理学常用研究方3.标记探针的纯化目的：去除无机盐、dNTP、酶等方法：沉淀离心法

加入EDTA中止反应，再加4MLiCl和乙醇冷冻离心，乙醇洗涤，干燥后用缓冲液溶解

玻璃纤维滤过法

反应物与玻璃纤维结合，清洗，缓冲液洗脱38分子病理学常用研究方法ppt课件3.标记探针的纯化38分子病理学常用研究方法ppt课件4.标记结果的检验目的：证实标记结果；估计探针得率；测试检测条件非同位素标记探针的检验：采用斑点印迹法不同浓度(10倍梯度稀释)的标记探针点尼龙膜常规检测系统显色未标记探针点膜后用标记探针杂交39分子病理学常用研究方法ppt课件4.标记结果的检验39分子病理学常用研究方法ppt课件不同浓度（10倍梯度稀释）的标记探针点尼龙膜DNA／RNA探针：0.01pg～1ng／ul寡核苷酸探针：0.08FM～50fM/ul紫外照光或加热120℃30’固膜缓冲液1洗膜（100mM马来酸，150mMNaC1，pH7.5）缓冲液2（1%阻断剂，缓冲液1配）30’抗DIG一碱性磷酸酶1：5000，孵育30’缓冲液1洗膜缓冲液3浸2’(100mMTris-HC1．100mMNaC1，50mMMgC12，pH9.5）显色液（NBT：BCIP，9:7），作用0.5～16h缓冲液3洗膜40分子病理学常用研究方法ppt课件不同浓度（10倍梯度稀释）的标记探针点尼龙膜40分子病理学常三、组织处理和标本制作

目的：保留好被测核酸维持形态结构

方法：新鲜取材、及时固定适当的固定液：4%多聚甲醛(用0.1MPB配制)

用于：冰冻或石蜡切片细胞培养片、细胞涂片或切片41分子病理学常用研究方法ppt课件三、组织处理和标本制作41分子病理学常用研究方法ppt课DNA稳定性好，一般不需特殊处理

RNA酶的灭活(杂交前)：组织内的Rnase:固定剂灭活玻璃器皿：180℃处理3h以上用DEPC(二乙基焦碳酸盐)水处理试剂：用DEPC水配制和/或高压消毒带手套操作RNase抑制剂42分子病理学常用研究方法ppt课件DNA稳定性好，一般不需特殊处理42分子病理学常用研检测RNA时标本制备及玻片处理常规：

切片处理：切片插架──热水稀释的中性洗涤剂浸泡30'──流水冲洗──高压消毒──流水冲洗──蒸馏水洗──180℃3h──APES处理(2%APES/甲醇）室温1'，甲醇洗──DEPC水洗──阴干

标本处理：4%多聚甲醛(PB配)4℃过夜──乙醇脱水──二甲苯透明──石蜡包埋──切片

DEPC水：0.1DEPC，室温放置3h，高压消毒43分子病理学常用研究方法ppt课件检测RNA时标本制备及玻片处理常规：43分子病理学常用研究方四、原位分子杂交

要求：提高敏感性降低非特异着色

方法：去垢剂(TritonX-100)：增强组织通透性

蛋白酶(蛋白酶K)消化：增加通透性、去除杂蛋白

稀酸：杂蛋白变性、去内源性酶、暴露靶核酸

乙酰化处理：中和阳离子，减少静电吸引

适当的杂交条件：温度、离子强度、pH探针的种类、大小、浓度

杂交液：葡聚糖：增加探针相对浓度鱼精DNA、tRNA的应用：封闭

充分洗涤44分子病理学常用研究方法ppt课件四、原位分子杂交44分子病理学常用研究方法ppt课件1.杂交前处理石蜡切片常规脱蜡，PB洗片，[TritoX-100]蛋白酶K消化，37℃，(1～15μg/ml，15～120')4%多聚甲醛后固定，室温10'PB洗片1～2'×2；0.2MHCl，室温10'；PB洗片1～2'×20.1M三乙醇胺(DEPC-H2O配)，室温2～3'三乙醇胺/无水乙酸室温10'PB洗片，室温2'×270%→80%→90%→100%→100%酒精脱水室温干燥45分子病理学常用研究方法ppt课件1.杂交前处理45分子病理学常用研究方法ppt课件2.杂交（预杂交）滴加杂交工作液，蜡膜盖片，湿盒内，50℃16～20h(检测DNA时要求先变性(90~100度)，探针为双链DNA也要变性)

杂交液：甲酰胺50%Tris-HClpH7.610mMDEPC-H2OEDTApH8.01mM加到50.0mlNaCl600mM-70℃保存Denhart's液1×SDS0.25%46分子病理学常用研究方法ppt课件2.杂交46分子病理学常用研究方法ppt课件50%×Denhart's液：聚蔗糖(Ficoll400)10g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)10g牛血清白蛋白(BSA)10gDEPC-H2O1000ml杂交工作液：1ml杂交液加tRNA(最终浓度0.3～0.5mg/ml)加标记探针(最终浓度0.5～5μg/ml)每张切片用50μl47分子病理学常用研究方法ppt课件50%×Denhart's液：聚蔗糖(Ficoll400杂交条件的优化：

温度：温度高反应快，温度太高破坏组织，一般Tm-25℃G:C多者Tm高(G:C50%Tm约为70℃)甲酰胺可降低杂交温度(1%下降0.35～0.65℃)

探针：长的杂交快(太长时穿透性差)复杂性高的杂交时间长浓度高杂交时间短离子强度和pH：离子强度高杂交体稳定性好（0.01-0.4M)两价阳离子可使DNA结合牢固，用EDTA去除常用50%甲酰胺，pH6.5～7.5，45～65℃，杂交16～20h48分子病理学常用研究方法ppt课件杂交条件的优化：48分子病理学常用研究方法ppt课件3.杂交后处理

洗片：5×SSC，50℃1'去膜；5×SSC，50℃5'2×SSC+50%甲酰胺，50℃30'TNE(Tris-HClpH7.6+NaCl+EDTA)，37℃10'

RnaseA(1mg/100mlTNE)，37℃30'TNE，37℃10'2×SSC，50℃15'；0.2×SSC，50℃15'×2

严格度：甲酰胺浓度高温度高高严格度离子强度低49分子病理学常用研究方法ppt课件3.杂交后处理49分子病理学常用研究方法ppt课件4.显色反应(大致同免疫组化)BufferⅠ(0.1MTris-HClpH7.5含0.15MNaCl)，室温1'1.5%阻断剂(用BufferⅠ加热配制)，室温45'抗DIG-AP，37℃30～60'，4℃过夜BufferⅠ，室温15'×2BufferⅢ浸片(0.1MTris-HCl+0.1MNaCl+50mMMgCl2，pH9.5)，室温5'，显色液(NBT+BCIP+2mlBufferⅢ)，避光室温，30'以上TE(10mMpH7.6Tris-HCl+1mMEDTA)中止反应H2O洗片甘油明胶封片50分子病理学常用研究方法ppt课件4.显色反应(大致同免疫组化)50分子病理学常用研究方法5.对照阴性组织片对照阳性组织片对照(包括分布)探针Northernblot检测探针正义链阴性对照不标记探针竞争抑制不含探针的阴性对照(显色阶段对照)DNase或RNase消化后阴性对照(非核酸吸附)核酸原位杂交与蛋白产物的免疫组化检测对照其他阳性或阴性对照（载体对照）51分子病理学常用研究方法ppt课件5.对照51分子病理学常用研究方法ppt课件四、杂交组化技术的进展1.双重及多重杂交组化技术（最好选择不同的检测系统）2.与免疫组化结合应用双重检测(一般先作免疫组化)同时检测核酸和蛋白产物3.电镜下的杂交组化方法与免疫电镜相似多采用PG或PLP固定、包埋后法、胶体金标记细胞则多用包埋前法52分子病理学常用研究方法ppt课件四、杂交组化技术的进展52分子病理学常用研究方法ppt课4.原位PCR技术将PCR与杂交技术结合起来，以提高敏感性间接原位PCR：先扩增后杂交方便、敏感、特异性差直接原位PCR：加入引物、标记核苷酸、DNA聚合酶等，直接以靶链为模板合成DNA并检测出相对的DNA杂合体5.原位反转录PCR（也分直接和间接法）在PCR扩增前先进行反转录，rTth酶的出现使其更为容易53分子病理学常用研究方法ppt课件4.原位PCR技术53分子病理学常用研究方法ppt课件五、杂交组化的应用1.病原体的检测病毒：HPV(16，18)──宫颈癌

EBV──鼻咽癌

HBV──肝癌、肝炎──肾炎(IgA肾病)

CMV──AIDS病等原位PCR显示肝炎肝细胞内HCV阳性54分子病理学常用研究方法ppt课件五、杂交组化的应用原位PCR显示肝炎肝细胞内HCV阳性54

2.肿瘤基因检测癌基因的染色体定位癌基因mRNA检测──癌基因活化宫颈癌癌细胞内p53的表达55分子病理学常用研究方法ppt课件宫颈癌癌细胞55分子病理学常用研究方法ppt课件3.mRNA检测(敏感性较Northernblot低，可精确到细胞水平)原位杂交显示肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞TIMP-2阳性56分子病理学常用研究方法ppt课件3.mRNA检测原位杂交显示肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞T荧光原位杂交---FluorescenceInSituHybridization原理采用荧光标记的DNA探针，利用探针与被检测样本DNA碱基对的互补性，在探针与样本的DNA杂交后，通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞，组织样本中的染色体异常。57分子病理学常用研究方法ppt课件荧光原位杂交原理57分子病理学常用研究方法ppt课件FISH：“钓鱼”技术58分子病理学常用研究方法ppt课件FISH：“钓鱼”技术58分子病理学常用研究方法p59分子病理学常用研究方法ppt课件59分子病理学常用研究方法ppt课件细胞周期的不同阶段60分子病理学常用研究方法ppt课件细胞周期的不同阶段60分子病理学常用研究方法ppt课件61分子病理学常用研究方法ppt课件61分子病理学常用研究方法ppt课件探针是一段荧光标记的核酸（DNA）片段，被用作寻找另一互补DNA(靶标）的指示。DNA靶标可能是一个特异性条带、一个基因、一个染色体片段或一个完整染色体探针（probe)及靶标（target)62分子病理学常用研究方法ppt课件探针是一段荧光标记的核酸探针（probe)及靶标（targ适用于间期FISH的标本石蜡切片分离细胞核肿瘤组织的印片细胞离心涂片血液或骨髓涂片细胞爬片或切片63分子病理学常用研究方法ppt课件适用于间期FISH的标本石蜡切片63分子病理学常用研究方FISH探针的类型全染色体涂抹探针（WCP）染色体计数（着丝粒）探针（CEP）位点特异性探针（LSI）双色分离重排探针双色双融合易位探针xyxx64分子病理学常用研究方法ppt课件FISH探针的类型全染色体涂抹探针（WCP）xyxx64可检测样本包括65分子病理学常用研究方法ppt课件可检测样本包括65分子病理学常用研究方法ppt课件66分子病理学常用研究方法ppt课件66分子病理学常用研究方法ppt课件临床应用领域67分子病理学常用研究方法ppt课件临床应用领域67分子病理学常用研究方法ppt课件68分子病理学常用研究方法ppt课件68分子病理学常用研究方法ppt课件TERC基因69分子病理学常用研究方法ppt课件TERC基因69分子病理学常用研究方法ppt课件70分子病理学常用研究方法ppt课件70分子病理学常用研究方法ppt课件

HPV→hTERC=宫颈癌？71分子病理学常用研究方法ppt课件

HPV→hTERC=宫颈癌？71分子病理学常用研究方72分子病理学常用研究方法ppt课件72分子病理学常用研究方法ppt课件子宫颈癌研究最新进展中国医学论坛报/2008年/12月/4日/第B03版IGCS2008会议报道hTERC扩增诊断宫颈癌及癌前病变

目前宫颈癌筛查主要通过宫颈细胞学检查及人乳头状瘤病毒（HPV）检测，但这些方法的临床应用均有一定局限性。今年的研究致力于寻找新的指标来协助诊断宫颈癌前病变，尤其是鉴别出高度病变，以提高筛查的准确性和可预测性。人端粒酶RNA（hTERC）是人端粒酶组分之一，有研究证实，端粒酶激活是HPV整合入宫颈细胞后，上皮内瘤样病变（CIN）向宫颈癌转化的关键步骤。此次大会口头报告中北京大学人民医院魏丽惠等提交的一项研究颇为引人注目，该研究发现，通过荧光原位杂交（FISH）检测宫颈细胞学涂片中hTERC基因扩增情况，在宫颈癌和癌前病变诊断中具有重要价值。73分子病理学常用研究方法ppt课件子宫颈癌研究最新进展中国医学论坛报/2008年/12月/4日TERC与子宫颈癌级别国内1000多例临床实验结果74分子病理学常用研究方法ppt课件TERC与子宫颈癌级别国内1000多例临床实验结果74分子病TERC在临床中的意义75分子病理学常用研究方法ppt课件TERC在临床中的意义75分子病理学常用研究方法ppt课TERC在临床中的意义-风险预测针对HPV高危的宫颈癌易感人群,在常规TCT筛查的基础上,加做TERC基因检测,可帮助医生判断病人疾病风险76分子病理学常用研究方法ppt课件TERC在临床中的意义-风险预测针对HPV高危的宫颈癌易感人

改进的子宫颈癌筛查与诊断手段77分子病理学常用研究方法ppt课件改进的子宫颈癌筛查与诊断手段77分子病理学常用研究方法TERC在临床中的意义-CIN1患者的分流治疗78分子病理学常用研究方法ppt课件TERC在临床中的意义-CIN1患者的分流治疗78分子病TERC在临床中的意义-CIN1患者的分流治疗79分子病理学常用研究方法ppt课件TERC在临床中的意义-CIN1患者的分流治疗79分子病理TERC在临床中的意义-CIN2患者的分流治疗80分子病理学常用研究方法ppt课件TERC在临床中的意义-CIN2患者的分流治疗80分子病理TERC在临床中的意义-术后评估，复发监测

TERC（-）：手术病灶切除干净，并无复发，定期随访观察TERC（+）：高度怀疑有病灶没有被完全切除，或者有复发。根据病人情况再次进行手术治疗81分子病理学常用研究方法ppt课件TERC在临床中的意义-术后评估，复发监测

TERC（-）：TERC在临床中的意义-鉴别诊断对于30岁以前HPV阳性的病人，大多是一过性感染，可用TERC探针进行鉴别诊断。

TERC（-）：一过性感染TERC（+）：有癌变风险，采取治疗措施对于怀孕期的妇女，雌激素可使移行带区的基底细胞出现不典型增生甚至类似原位癌的改变，与宫颈原位癌鉴别困难。但前者在产后能恢复正常。TERC（-）：雌激素引起，无需治疗，产后自然恢复正常TERC（+）：高度怀疑原位癌，密切随诊，产后六周进行相应治疗82分子病理学常用研究方法ppt课件TERC在临床中的意义-鉴别诊断对于30岁以前HPV阳性的病TERC在临床中的意义-鉴别诊断CIN1和CIN2病理学上有时难以区分，但是对指导临床的治疗有重要意义TERC（-）：90%可能为CIN1，按CIN1方案治疗TERC（+）：90%可能为CIN2，按CIN2方案治疗83分子病理学常用研究方法ppt课件TERC在临床中的意义-鉴别诊断CIN1和CIN2病理学上有TERC指导临床治疗小结84分子病理学常用研究方法ppt课件TERC指导临床治疗小结84分子病理学常用研究方法ppt临床常用检测项目-宫颈癌85分子病理学常用研究方法ppt课件临床常用检测项目-宫颈癌85分子病理学常用研究方法pp三种检测方法比较方法特异性（％）敏感性（％）形态学检测9055-80HPV检测64－9584-100FISH909086分子病理学常用研究方法ppt课件三种检测方法比较方法特异性（％）敏感性（％）形态学检测905TERC基因阳性图原位癌术后复查87分子病理学常用研究方法ppt课件TERC基因阳性图原位癌术后复查87分子病理学常用研究方法TERC基因阴性图88分子病理学常用研究方法ppt课件TERC基因阴性图88分子病理学常用研究方法ppt课件TERC基因FISH检测检测样本：TCT采集、生理盐水采集、活检标本石蜡切片、手术标本石蜡切片89分子病理学常用研究方法ppt课件TERC基因FISH检测检测样本：89分子病理学常用研究方法90分子病理学常用研究方法ppt课件90分子病理学常用研究方法ppt课件FISH检测TERC基因的结果判读：标本为新鲜宫颈细胞制片：阈值建立采集20例正常人宫颈细胞。阈值测定：每例分析至少100个细胞，统计出现2个以上TERC信号细胞数目的百分比。阈值=平均数（M）+3X标准差（SD）结果判断每例样本随机计数细胞（至少100个），如果检测值大于阈值，判定为阳性结果；如果检测值小于阈值，判定为阴性结果；如果检测值等于阈值，加大观测样本细胞数目。标本为组织石蜡切片：连续3个细胞出现2个以上TERC信号，即判为阳性。91分子病理学常用研究方法ppt课件FISH检测TERC基因的结果判读：91分子病理学常用研究方FISH检测Her-2基因扩增92分子病理学常用研究方法ppt课件FISH检测Her-2基因扩增92分子病理学常用研究方法93分子病理学常用研究方法ppt课件93分子病理学常用研究方法ppt课件94分子病理学常用研究方法ppt课件94分子病理学常用研究方法ppt课件95分子病理学常用研究方法ppt课件95分子病理学常用研究方法ppt课件96分子病理学常用研究方法ppt课件96分子病理学常用研究方法ppt课件97分子病理学常用研究方法ppt课件97分子病理学常用研究方法ppt课件Her-2基因扩增模式98分子病理学常用研究方法ppt课件Her-2基因扩增模式98分子病理学常用研究方法ppt课Her-2基因扩增模式99分子病理学常用研究方法ppt课件Her-2基因扩增模式99分子病理学常用研究方法ppt课100分子病理学常用研究方法ppt课件100分子病理学常用研究方法ppt课件赫赛汀在胃癌中的应用101分子病理学常用研究方法ppt课件赫赛汀在胃癌中的应用101分子病理学常用研究方法ppt课102分子病理学常用研究方法ppt课件102分子病理学常用研究方法ppt课件随访终点指标103分子病理学常用研究方法ppt课件随访终点指标103分子病理学常用研究方法ppt课件赫赛汀在胃癌中的应用—小结104分子病理学常用研究方法ppt课件赫赛汀在胃癌中的应用—小结104分子病理学常用研究方法p105分子病理学常用研究方法ppt课件105分子病理学常用研究方法ppt课件TOP2A基因106分子病理学常用研究方法ppt课件TOP2A基因106分子病理学常用研究方法ppt课件测TOP2A基因的意义107分子病理学常用研究方法ppt课件测TOP2A基因的意义107分子病理学常用研究方法ppt108分子病理学常用研究方法ppt课件108分子病理学常用研究方法ppt课件计数100个细胞，统计Ratio值（红信号数/绿信号数）FISH阳性：1.EGFR基因扩增（1）Ratio≥2为阳性结果，提示该样本有EGFR基因扩增（2）大于等于15个红色信号的细胞数占细胞总数的10%以上，为阳性结果，提示该样本有EGFR基因扩增（3）出现成团扩增的细胞，为阳性结果，提示该样本有EGFR基因扩增2.高多体性

Ratio＜2，但大于等于4个红色信号的细胞占细胞总数的40%以上，为阳性结果，提示该样本为EGFR基因高多体性扩增FISH阴性除以上阳性情况上，其余结果均为阴性结果109分子病理学常用研究方法ppt课件计数100个细胞，统计Ratio值（红信号数/绿信号数）10淋巴瘤的诊断和治疗——对病理医生和临床医生的挑战淋巴瘤的分类复杂（2008年WHO分类）不同类型的淋巴瘤有着不同的预后，需要不同的治疗；即使是相同类型的肿瘤，由于携带不同的分子遗传学异常，对治疗的反应也可能不同;多数淋巴瘤综合临床特征、组织形态学、免疫表型特征可得到正确诊断;分子遗传学的检测可以提供更多普通病理学检查所不能提供的信息。110分子病理学常用研究方法ppt课件淋巴瘤的诊断和治疗——淋巴瘤的分类复杂（2008年WHO分诊断BCDA临床特征形态学免疫表型分子遗传学淋巴瘤诊断—临床特征、形态学、免疫表型及分子遗传学相结合111分子病理学常用研究方法ppt课件诊断BCDA临床特征形态学免疫表型分子遗传学淋巴瘤诊断1淋巴瘤常见的染色体易位及所累及基因112分子病理学常用研究方法ppt课件淋巴瘤常见的染色体易位及所累及基因112分子病理学常用研究方FISH检测淋巴瘤分子遗传学异常的常用探针双色分离重排探针（DualColorBreakApartRearrangementProbe）双色双融合易位探针（DualColor，DualFusionTranslocationProbe）染色体计数探针（Chromosomeenumerationprobe,CEP）113分子病理学常用研究方法ppt课件FISH检测淋巴瘤分子遗传学异常的常用探针双色分离重排探针1①切片准备：选择杂交区域，脱蜡水化、酶消化、脱水干燥②变性、杂交③洗涤、封片④观察：荧光显微镜。间期FISH方法114分子病理学常用研究方法ppt课件①切片准备：选择杂交区域，脱蜡水化、酶消化、间期FISH方法间期FISH结果观察与解读115分子病理学常用研究方法ppt课件间期FISH结果观察与解读115分子病理学常用研究方法p双色分离重排探针（BCL2）正常分离基因拷贝数增加116分子病理学常用研究方法ppt课件双色分离重排探针（BCL2）正常分离基因拷贝数增加116分子间期FISH结果观察与解读117分子病理学常用研究方法ppt课件间期FISH结果观察与解读117分子病理学常用研究方法p正常融合基因拷贝数增加双色融合易位探针(IGH/BCL2）118分子病理学常用研究方法ppt课件正常融合基因拷贝数增加双色融合易位探针(IGH/BCL2）间期FISH结果观察与解读119分子病理学常用研究方法ppt课件间期FISH结果观察与解读119分子病理学常用研究方法p正常染色体数目增加染色体着丝粒探针（2号染色体，橙色）120分子病理学常用研究方法ppt课件正常染色体数目增加染色体着丝粒探针120分子病理学常用研究方有助于诊断、分类通过特异性遗传学异常来确定淋巴瘤的类型判定预后、指导治疗

FISH检测淋巴瘤分子遗传学异常的意义121分子病理学常用研究方法ppt课件有助于诊断、分类FISH检测淋巴瘤分子遗传学异常的意义121间期FISH在淋巴瘤中的应用举例侵袭性成熟B细胞淋巴瘤小细胞性B细胞淋巴瘤

外周T细胞淋巴瘤

B淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病122分子病理学常用研究方法ppt课件间期FISH在淋巴瘤中的应用举例侵袭性成熟B细胞淋巴瘤12Burkitt淋巴瘤(BL)t(8q24)/IG-cMYC具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之间特征的不能分类的B细胞淋巴瘤(IntermediateBL/DLBCL)（Double-hit）t(8q24)/nonIG-cMYC（35-50%）t(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2

（15%）t(3q27)/BCL6-IGH

（少）弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)（Double-hit）

t(8q24)/IG(nonIG)-cMYC（10%）

t(3q27)/BCL6（30%）t(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2

（20-30%）t(3;14)(p14;q32)/FOXP1-IGH（3%）侵袭性成熟B细胞淋巴瘤123分子病理学常用研究方法ppt课件Burkitt淋巴瘤(BL)侵袭性成熟B细胞淋巴瘤123分利用FISH检测以上三个类型淋巴瘤的分子遗传学异常，通常使用以下探针：双色分离重排探针：IGH、C-MYC、BCL2、BCL6双色双融合易位探针：IGH/C-MYC

侵袭性成熟B细胞淋巴瘤124分子病理学常用研究方法ppt课件利用FISH检测以上三个类型淋巴瘤的分子遗传学异常，通常使用Burkitt淋巴瘤

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