uplc-msms法测定大蓟中7个吡咯里西啶生物碱的含量

uplc-msms法测定大蓟中7个吡咯里西啶生物碱的含量

氨基丙烯酸酯（pas）是由富含特定植物的天然内源性毒性药物合成的。它具有肝脏毒性、肿瘤和突变等毒性。这些物质是食品和保健品中的毒性成分，可以通过药物或食物链的形式传递，导致人类中毒。迄今为止，PAs已在13个科的植物中检出，存在最多的是菊科、紫草科和豆科。在吡咯啶环的1,2位为双键的PAs均具有肝脏毒性，称为肝毒性PAs。PAs在体内可与DNA产生络合，引起肝细胞损伤，长期过量摄入可造成肝脏肿瘤等不良后果大蓟为菊科植物蓟CirsiumjaponicumFisch.exDC.的干燥全草，是2020年版《中华人民共和国药典》收载的中药材品种，具有凉血、止血及散瘀、解毒、消痈的功效，用于衄血、吐血、尿血、便血、崩漏、外伤出血、痈肿疮毒等疾病的治疗1试剂和仪器WatersAcquity对照品印美定(批号13420)、石松胺(批号12183)、N-氧化凌德草碱(批号15599)、N-氧化印美定(批号13418)和N-氧化石松胺(批号13484)均购于PhytoLabGmbH公司，对照品凌德草碱(批号ZZS19092908)和克氏千里光碱(批号ZZS19072502)均购于上海甄准生物科技有限公司，对照品纯度均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸和甲酸铵均为质谱级，Fisher公司，其他试剂为分析纯。大蓟样品共10批(编号分别标记为S1～S10)，分别采自广西、云南、山东和江苏等地，经中国食品药品检定研究院中药所昝珂副研究员鉴定为蓟CirsiumjaponicumFisch.exDC．的干燥全草。2方法和结果2.1溶液的制备2.1.1对照品溶液的确定精密称取印美定、石松胺、凌德草碱、N-氧化凌德草碱、N-氧化印美定、N-氧化石松胺和克氏千里光碱的对照品适量，分别以10%乙腈水配成质量浓度分别为1.024、1.032、1.016、1.022、1.056、0.958和0.988μg·mL2.1.2试验溶液取药材粉末(过4号筛)4.0g，置于具塞锥形瓶中，加入0.05mol·L2.2色谱柱的确定色谱柱:WatersACQUITYUPLCHSST3色谱柱(100mm×2.1mm,1.8μm);柱温:40℃;流动相:0.05%甲酸和2.5mmol·L2.3方法研究2.3.1线性关系的测定精密吸取各对照品储备液0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL，分别置于6个50mL量瓶中，加10%乙腈水定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得系列浓度的混合对照品溶液;按照上述色谱-质谱条件进行测定。以对照品的峰面积Y为纵坐标，对应的浓度X为横坐标，进行线性回归。取线性关系考察用混合对照品溶液，继续用10%乙腈水稀释一定倍数后，进样测定，以定量离子的色谱峰信噪比S/N≥3对应的最低浓度为检测下限(LLOD)，以定量离子色谱峰信噪比≥10对应的最低浓度为定量下限(LLOQ)，结果见表2。2.3.2计算rsd精密吸取“2.1.1”项的混合对照品溶液1μL，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果显示印美定、石松胺、凌德草碱、N-氧化凌德草碱、N-氧化印美定、N-氧化石松胺和克氏千里光碱峰面积的RSD(n=6)分别为2.7%、2.9%、2.2%、2.8%、2.1%、2.8%和1.9%，表明仪器精密度良好。2.3.3计算rsd取同一份供试品溶液(样品S1)，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，计算RSD。结果印美定、石松胺、凌德草碱、N-氧化凌德草碱、N-氧化印美定、N-氧化石松胺和克氏千里光碱峰面积的RSD(n=6)分别为2.5%、2.2%、2.6%、3.0%、3.2%、2.8%和3.3%，表明供试品溶液在24h内稳定。2.3.4计算rsd按照“2.1.2”项方法制备样品S1的供试品溶液6份，分别进样测定，计算RSD。结果印美定、石松胺、凌德草碱、N-氧化凌德草碱、N-氧化印美定、N-氧化石松胺和克氏千里光碱的平均含量(n=6)分别为5.22、1.42、5.64、7.34、13.68、2.62和3.65μg·kg2.3.5对照品溶液的制备精密称取印美定、石松胺、凌德草碱、N-氧化凌德草碱、N-氧化印美定、N-氧化石松胺和克氏千里光碱的对照品适量，精密称定，分别加10%乙腈水配制成上述7个成分质量浓度依次为25.60、6.88、25.40、34.07、70.40、13.69和19.76ng·mL2.4样品含量测定准确称取不同产地的大蓟药材4.0g，分别按照“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱-质谱条件进样测定，按外标法计算印美定、石松胺、凌德草碱、N-氧化凌德草碱、N-氧化印美定、N-氧化石松胺和克氏千里光碱的含量，结果见表3。3风险评估大蓟所测10批样品中7个PAs的含量总和为15.57～53.05μg·kg4讨论4.1高灵敏度与pas组分的关系印美定、石松胺、凌德草碱、N-氧化凌德草碱、N-氧化印美定、N-氧化石松胺和克氏千里光碱等为大蓟中主要的PAs成分，为痕量或超痕量组分，高灵敏度的UPLC-MS/MS法为首选检测方法。本实验采用UPLC-MS/MS法同时测定正离子模式下7个成分的MRM离子对，定量离子峰形好，其他物质无干扰，能够准确测定待测物质。4.2流动相对pas分离能力PAs成分极性较大，HSST3色谱柱对极性化合物具有较强的保留能力，能够兼容100%水相，因此选择该色谱柱用于实验研究。本研究考察了不同配比乙腈-水以及含有甲酸和甲酸铵等含酸溶液作为流动相对PAs分离能力的影响。由于所测化合物中有6个化合物为2组非对映异构体(组1:印美定、石松胺、凌德草碱;组2:N-氧化凌德草碱、N-氧化印美定和N-氧化石松胺)，非对映异构体的分子离子峰和质谱裂解行为基本一致，需要通过色谱柱将其分开，通过调节梯度比例，在25min内这2组非对映异构体均达到基线分离，最终确定流动相为含0.05%甲酸和2.5mmol·L4.3pas含量测定本研究建立的UPLC-MS/MS法可同时测定大蓟中7个主要PAs的含量，方法简便、准确且重复性好。10个批次的大