甲基化特异性PCR(MSP)原理及引物设计

MSP原理其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。引物设计原则标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfitesequencingPCR,BSP)除了标准PCR的一些参数外，“MethPrimer”应用3端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC含量、解链温度(Tm)，而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别，以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”,所以“MethPrimer”中默认的重复“T”为8个,而其他碱基重复数为5个。DNA的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C”区域作为源序列，设计引物。对于BSP,引物设计的原则[1]:①为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;②引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。对于MSP需要设计2对引物，一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲基化的DNA;根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA。MSP引物设计的原则:①为了最大限度的区分甲基化与非甲基化，引物的3’端至少包含1个CpG位点，我们可以自己设定CpG的“C”距3’末端的最远距离。“MethPrimer”中默认值为3,即是在引物的最后3个碱基中,至少有1个是CpG的“C”。②引物序列中应包含尽可能多的CpG位点。③甲基化引物和非甲基化引物序列3’端应处于相同的CpG位点。如果，2对引物不在相同的CpG位点退火,PCR结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物长,因为受Tm值限制，由于非甲基化引物中的“C”转化成“T”，导致GC含量降低，从而引起Tm降低。④2套引物应有相近的Tm值，“MethPrimer”中默认2套引物Tm值相差不超过5°C，这种限制可使2个PCR反应在同一PCR仪中进行。问题解决参考/bbs/topic/91849277keywordsnMSP引物设计步骤(以CLEC14A基因为例)：找到目标基因的启动子区(promoter)序列首先打开ensembl页面：/index.html如图在搜索框第一个物种选择Human，基因填入要研究的基因名，点击GoCLEC14A Ge门它]EHSGOHWOI7643514.3^254103-3S256369.-1Otypelectintiomaincontaining14A[Sour£e:HGNCSymbol:Acc:HGNC:19332]O7YPELECTINDOMAINFAMILY14,MEMBERA;CLECUA[*618945]（MIMgenerecord;description:C-TYPELECTINDOMAINFAMILY14,MEMBERA;CLEC^A；!isanexternalreferencematchedLoGenezNSGOUOOQ17E435 生"Varianttable•Phsnoty|DR占■Location■B<ternm.l •Regulation*Orthologues■Cenetree搜索结果页面第一条下面箭头所指处Regulation，点击它（这里面主要是基因调控区域的信息）打开新的页面后，下拉至长长的表格，找到第一个promoter，长度在2000bp左右。EFl5R000002Td1i58尺赞」盘on/BuidJCTCFBindingSite143TBB14Q1-3JEB2flflO1324ShOHh田Er^flfl000274ie9Ens-arrUR«fuld.DiyCTCFBindingSite1437593301J75930QO2iaShan'田ENERQQOQM閱7的Eri阳的耐Reau就owBuidePPrarnot&r14拥59JM帖托9SMH19A2Shew田ErjsRunnnaa&rFSiEntBrrHRtpjlMDrvTFhndmgsite-14.3T597660-3T&9BD71670ShowElEbJ£Rflflfl00274l70GnsarrU氐quhtnrv比也1認CTCFBindingSrt«14-37597G01-37&WOO臥£h3vElEr.iSR0Q0D00&rrs2曰昨PfejLitecorvTF咖ding创忆143T602660-3TE03519964ShowSBuidg然后点击最右侧Show旁边的+,出现的就是启动子区的序列了E啥咖E啥咖Pramoteru躬5B4EDL1932Rgyulalary IHuldgAlifaKIfiSZJyjICCTGiirip■:AACTMIiriKil&ZiAIKZIIIGT'a-Lft.iiriiliiLAAlAXOXAIFJJyjETSiXSiidiyaEE&KAAI&LigiLJLHJKnxrjMHCiyS屈匸用]：昭翊UarriTB泪郭Elfcj施AAM跖■::CTTCTsZfCaiAMl&^CrmsiMySKACAi^nTTlCJUUdniAfiJJGICiSmClTTAITW迢仙 咒[旳二苗口翊層:GCmUVTCM迢&宓:WICDNami临卫GIi»3AC&UylAS<3r?KCTD3IGO3rAIWTCCG<3i：TIIC^：aQft.GTrGCrDXAAJCTi：将序列信息复制，然后就可以进入下一步

MSP引物设计打开MSP在线引物设计工具页面:/methprimer/或者他们新开发的2.0页面/methprimer2/进入后我们选择第一个就好ycutodesignpnmersFormosbisuntAcon^rsionbasedFCRprimersand10predictCpGislandsonaninputsequeficeliadsoallwyoutoseardhifor卩redesignedprimersforhunanandrnaieegenesD^lgnpriiinerton”ourirnpuitseciuerice.PastaanORlGlhlALDhlAseoj^nc^..Input抽QuencodossrftneedwrtuaJbi^urfitaco^Qision(e.g.convert'CtoThT「yths帥nci©颗口沐工aeatrclhforpredesignedprimjersfarhuman^ndlmousegenes:Typeinthebo>:telawgeres^mbaLRefSeqIDtoEsardnfnrpre-deggnedpnmersfarprateincedinggenes.IncRNAs且rdmiRNAs>；egESRI忖站_00皿山曰mir-1-1PANDA)CpGWandprecHicbonrYoucanailsousetheprogramtopredictGpGiglandsinasequence.Pk:k^ELiFibs呂旦口4仃口旳PCIR(RSPjpturrerE那QMKGE皿CC^KO?連茁CCKJ^CJTKCTCTCAiXTCCniC^KIlTiraT^TM匚KrTOZJCrOGJZTGGTTTCATGiZCCrTOZAirTrZAJCJUQTTiXTjIACATOZTCCjUQCCAOHECC匚AXTACAACaiT匚匚AK匚CrGTKGJLAGOIAOGjROGGCCGOGCWCGO；CGGOXGGCiOSCCj&ZTtjUCJZACCTijZA^TCKCOQ^ZGCDXCGmXCOC^Ca：AOOOP^GOG-AJCJWtAACCrCKJWCKCGGWZGOQjPXrGOPZGGOGiSZGGO^ZGGCCCCCXCC0jXGCCfiCraCOP；CGGJZA£CCCJjZrCCiD5ZCCjlGiZCCGGJDSCOGJ^AjG匚GO：r：i：GOGJKAJWT；AJCOGQS：r(；O：TCrGO；JWGC|iJKrGCfiGrn；AQ：rGAr；TGGJLTinTKCTOjZTrQjKTGmZKCTDZTCCTOZTinODZCATTKrCOGiZCCCJlCAJUjCJl..OGbHClUCCTACMJKgmCETKAJCCTGCJUGGOROOKCCmZiKrOCgH^/ttOGJDZTCOZQZOOOXDGCTTCACOjZTGmxnJUDZCinODZmO^AJTOZTi^ft：CjUUQi：GGGWZCT€ACTrTGTTTGCjJUlfCAG-T'irJlATP；GTTTAJGGCOXG^MOjXCJJUU；JLCGCiUArGCXAjCCt«CGQ；TGrJUlCCQXTTTCCjlAAAAfiWLAJl*fKGiXGGGO：AJGGO»；OGW：GGGCTAJGGQ：TCrGG-fiTOGCWKCTOPZJWCOXXGjULQ；OOCCGCCXCTCJjXrO&；ACjUCTiXGCTTA£ACjlCCOQrXCATiUCPGjlCCCO&^rOCCTOOHMAGGTACKEOCACCTrOMMQlCG前Pk:k^ELiFibs呂旦口4仃口旳PCIR(RSPjpturrerEMSPpnmersPickMeHiMiahiBSPprimesPickMeHiMiahiBSPprimesPickNestedMSPpnmersPickCCABRApn™rs.<*气>56<*气>56E口G]sJkrri匚ediliionfarpnmerselerbnn?WindawShft□bs.!ExpGC%100▼Il・06进入引物设计页面后，我们把上一步得到的启动子区序列复制进这个大框框里，然后勾选箭头标示的两个选框，没有其他特殊要求其他部分均按默认选项设置就好。然后点击submit。将页面继续下拉即出现设计好的引物啦PrimerDesignResultsPrirnprri^rnpSeouenoef5'-£j 打』Lan皿Dme矶伽Gl%Serfm詢fwndTnG伽St曲山忖Ee- MF1GTTGTTGGGAMi^GGIAA'K；20414J33No24MD2C056.450.D7545MPflkMR1CTTAACO&WXTAAAMCGAAA23543521No2m58.G54.69046FTaducIsizePaj「或irtF*Hi『EndColS弓CoEDjirwCamoEndIniTmdiffSCOTE!130414543E5001000572.4133PnEErr^EeSprnenre；5'-J'l/Len泌血DeaeriFfsnipCdCsCsSetfmnvSelf日rdTm Stabihh-UF1GTmTTSQAAGAGGTAA宿TGTT23J14已36Nd242002MSSE