细胞永生化实验

正常细胞的寿命是有界限的，体内细胞是这样，体外培养的细胞也是如此。

细胞永生化实验则是针对体外培养的细胞而建立的。Hayflick界限Hayflick界限：体外培养的细胞，不是不死的，而是有一定寿命的，其增殖不是无限的，而是有一定界限，这个界限称为Hayflick界限。在体外培养的人正常细胞,经一段时间的分裂,就会进入一种生长抑制状态,即衰老期(M1期)。大多数真核生物细胞(生殖细胞、干细胞除外)都具有这种特性。经转化了的细胞可越过衰老期而进入另一增殖抑制状态,即危机期(M2期),危机期的细胞开始出现退化,并逐渐死亡。只有少数细胞在一定因素的影响下,端粒酶被激活,以自身RNA为模板合成端粒DNA来补充或延长端粒,恢复染色体的稳定性,从而使细胞越过危机期,发生了永生化。什么是细胞永生化？细胞永生化是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离,从而具有无限增殖能力的过程。正常细胞的增殖能力有限,经过一定时间的增殖后,最终会进入一种生长抑制状态,而一些肿瘤细胞可以无限增殖。细胞永生化意义了解细胞增殖与衰老的分子机制及保存一些重要疑难病例的样本。为治疗肿瘤、控制肿瘤细胞的增殖以及器官移植的研究奠定了坚实的基础。由于永生化细胞具有可以多次传代的这一特性,我们可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、增殖慢、易衰老的细胞获得永生,从而提供更多的细胞资源。秦巴山区MR家系人群资源库建立的意义本研究力图在先期研究积累的秦巴山区MR家系调查资料和遗传资源的基础上，建立秦巴山区MR家系资料库、DNA组织样品库、外周血B淋巴细胞永生细胞株库。一方面，可为我们今后进一步搜寻和定位MR的相关基因，开展MR遗传学和分子生物学研究提供长期可靠的遗传资源。另一方面，由于MR特别是NSMR主要表现为智力低下和认知与行为障碍，因此人们认为能引起NSMR的基因很可能与人的智力、认知能力的分子机制有关，与脑发育和脑功能的神经生物学基础有关系。所以本研究在建立MR家系资料库中所积累的MR家系人群的智力与行为测验资料，也将对进一步开展基因与认知的相关性研究，促进脑与认知神经科学的发展，开拓出认知神经遗传学的新领域有重要的基础研究意义。EB病毒转化人类外周血B-淋巴细胞建立永生细胞系

EB病毒(epsteinbarrvirus)转化外周血B淋巴细胞(B-LC),使其成为一种能连续分裂永久生存的类淋巴母细胞(lymphoblastoid),由此建立的类淋巴母细胞株即为永生细胞株

(immorta1izedcelllines),它可永远传代,并且每一种永生细胞株保存了原来提供血样个体的完整基因组,而且它的生化和分子生物学特性不发生变化,可作为生物标本库建立的首选方法。利用EB病毒转化外周血B-淋巴细胞建立精神发育迟滞永生细胞库,或各种疾病,特别是罕见疾病永生细胞库已成为当今永久保存全基因组的首选方法,

它可为精神发育迟滞及其它罕见疾病的遗传流行病学、临床遗传学、分子生物学等研究提供永久性试验材料。EB病毒的特征之一是对B细胞有天然的亲和力并使其发生转化,EBV引起的是一种无休止的细胞分裂和DNA的无限的合成。此外,EBV在体外对B细胞的转化效率很高,一般都能达到80%-100%。因为上述特点,世界上许多遗传研究中心都用此方法作为常规处理每一份血标本,建立人类遗传种质库。病毒转化后的B淋巴母细胞样细胞系(B-LCLs)依然保存了B细胞的分化特征和免疫表型，作为抗原递呈细胞，它可以摄取加工抗原，并将其载体部分表达于细胞表面，供T细胞受体识别；也可作为抗体基因的来源，将其与骨髓瘤细胞融合，制备分泌相应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。EBV简介Epstein-Barr病毒(EBV)是1964年首先从非洲恶性Burkitt淋巴瘤(BL)的淋巴母细胞系中发现的，属疱疹病毒科γ亚科。EBV有一个与其他DNA病毒不同的特点，就是它在体外对B细胞的感染可刺激细胞的持续性生长并引起细胞的永生化，从而形成淋巴母细胞样细胞系(1ymphoblastoidcelllines，LCLs),尤其对人二倍体淋巴细胞转化效果极佳。EBV主要通过结合人类B淋巴细胞膜上的EB病毒受体而感染B淋巴细胞，初次受到感染便被迅速致敏，36h后就可有DNA合成。被感染的B细胞在EB病毒核抗原的刺激下转化为类淋巴母细胞，其端粒酶活性提高，维护了细胞染色体端粒长度的稳定，并能够不断分裂增殖，从而促使B淋巴细胞的永生性生长。转化的细胞株染色体稳定，保留了原有的遗传性状。人淋巴细胞转化是建立永生细胞系及进行细胞遗传和分子遗传研究的极好方法。实验材料和方法试剂产生EBV的B95-8细胞株，RPMI1640培养基，PBS缓冲液，胎牛血清，淋巴细胞分离液，环孢霉素A，植物凝集素，台盼蓝染液标本的收集取样：无菌、轻轻摇动使血液与肝素混匀秦巴山区精神发育迟滞患者家系（两天之内的血样）实验方法

EB病毒的制备EB病毒基因组序列及其表达研究主要是用B95-8株进行的,B95-8细胞系是用传染性单核细胞增多症患者的EB病毒感染绒猴B淋巴细胞建立的。在B95-8细胞系中只有很少一部分细胞可以自发产生病毒,其他细胞呈隐性状态,用不同的诱生剂如TPA诱生后,使产生病毒的细胞明显增加。B95-8在EB病毒转化B-淋巴细胞过程中非常重要,通过培养B95-8细胞制备出大量高效价的EB病毒液,对于B95-8细胞的培养质量是EB病毒转化B-淋巴细胞成败的关键。复苏B95-8细胞株，加入无血清RPMI-1640培养液，1000r/min离心10min,弃上清，加入完全RPMI-1640培养液(含10％FBS，含Pen／Strep)，每2-3d半量加液一次，待细胞数达到lxl06／mL时，饥饿细胞4-7d后，收集上清液，-70℃及37℃反复冻融3次,再转移至离心管中,2000r/min离心15min，将上清液用0.22μm滤膜过滤后分装至1.5mlEpendof管中,平均1.2ml/管,-80℃保存。淋巴细胞EBV转化法（1）将血样静置30分钟，期间进行下一步实验。（2）冰箱中取出4℃避光保存的淋巴细胞分离液。摇匀后在无菌状态下取4mL加入刻度离心管中，37℃水浴中平衡。（3）PBS缓冲液将血样1:1稀释混匀（各3mL）。（4）将稀释的血液沿离心管壁徐徐加到分离液液面上。（5）室温下2000r/m离心20m。2000rpm,30minPBMC红细胞、粒细胞稀释的血浆、血小板FicollFicoll（6）吸出淋巴细胞上方2-3mm的透明血浆。将吸管轻轻沿离心管周缘吸出血浆层与分离液层界面间的白膜层细胞，以及它下面一半的淋巴细胞分离液，然后转移到另外一个离心管中。（7）洗涤充分混匀后，2000r/m离心10m。沉淀经PBS缓冲液吹打清洗。吹打均匀后对细胞进行计数。

计数方法如下：取5μL洗涤液与5μL1%台盼蓝染色液在小离心管混合均匀，将其吸出置于计数板上于倒置显微镜下检测细胞活力（应大于95%），并计数细胞。通常，每毫升外周血可得1×106~2×106个

PBMC。在染色期间可对细胞进行第二次洗涤操作，首先吸出离心管内的PBS缓冲液，然后再加入新的PBS缓冲液，2000r/m离心10m。管内沉淀即为所需细胞。（8）分离的淋巴细胞悬于1mL含EBV的上清，密度为2×106/mL，T25组织培养瓶中垂直放置于CO2培养箱3h孵育。（9）培养2000r/m离心10m，5mLRPMI1640完全培养液重悬，加入终浓度为0.2μg/mL的环孢霉素A，充分混匀后等量移入T25组织培养瓶内，置于37℃，5%CO2培养箱培养。待液体稍黄，补加2mL完全培养基。（10）冻存与复苏将培养好的细胞进行冻存，之后过一段时间进行复苏，并检测细胞活力。实验结果1、LCLs的光镜下形态接种后7～15d，培养板内可以看见有细胞体积增大、变形呈梭状；细胞变透亮，开始出现细胞分裂、聚团，大约2～3周开始形成细胞克隆团。以后，随着细胞分裂增生，细胞数量不断增多，细胞克隆团不断增大，呈悬浮式生长，高倍镜下可见细胞团边缘有毛刺状突起。1d4d7d20d30d2、染色体核型分析G带分型染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。在所有的显带技术中，G显带（Gbanding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（Gband）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。3、病毒基因检测EBV基因组含有100多个开放阅读框(ORF),在这100多个基因中只有几个在EBV潜伏感染的B淋巴细胞中表达,称为潜伏基因。根据这些基因的细胞内定位,将其表达产物分为三大类：EBNA蛋白家族(EBV核抗原-1，EBV核抗原-2，EBV核抗原-LP，EBV核抗原-3)、LMP蛋白家族(潜伏膜蛋白1、潜伏膜蛋白-2A、潜伏膜蛋白-2B)以及两种非多聚腺苷酸化的小RNA(EBER1和EBER2)。突变的试验病毒株和病毒重组体的研究证明，大部分潜伏蛋白的表达对于B细胞的有效永生化是必需的。这些潜伏蛋白在EBV介导的细胞永生过程中起着重要的作用。对EB病毒转化活性的研究表明，EB病毒的潜伏膜蛋白l（LMP1）基因是EB病毒永生化基因中唯一能够使体外培养的人或啮齿类动物细胞恶性转化的致瘤性基因。潜伏膜蛋白1（LMP1）是EBV在潜伏状态时表达的蛋白质，在许多EBV相关的疾病及肿瘤中表达，是众多EBV编码蛋白中被明确证明能恶性转化鼠纤维母细胞、B细胞和人上皮细胞的蛋白，LMP1促转化致瘤作用机制其实非常复杂需进一步阐明，尤其是目前对LMP1与宿主蛋白间的相互作用知之甚少。LMP1缺失的EBV重组体不再能转化B细胞，说明LMP1对于细胞的转化是必不可少的。具体操作提总RNA反转录合成c