克氏原螯虾虾壳中虾青素酯的水解工艺研究

克氏原螯虾虾壳中虾青素酯的水解工艺研究

虾青素主要来自天然藻类。除少量虾青素外，大部分虾青素通过添加过量的虾青素来芳基苯乙烯和羧基酯形成虾青素酯，然后与蛋白质结合参与虾皮合成。脂肪酶是一种甘油酯水解酶,其活性中心三元组中的组氨酸能从丝氨酸上吸收一个质子,使得丝氨酸亲核攻击酯键上的碳原子,形成极其不稳定的脂肪酶-底物四面体过渡态,并迅速将底物裂解为脂肪酸和目标水解产物试验以克氏原螯虾虾壳为原料,以虾青素提取量为评价标准,利用脂肪酶水解虾青素酯制备虾青素,重点研究脂肪酶添加量、酶解温度、溶液pH及酶解时间等因素对虾青素酯水解效果和虾青素提取量的影响,并通过正交试验对酶解条件进行优化,旨在获得最佳酶解工艺,为克氏原螯虾虾壳的综合利用提供理论依据。1材料和机器1.1虾青素so文件克氏原螯虾:由盱眙龙盛龙虾养殖场提供;虾青素标准品:Sigma公司;脂肪酶(酶活力25730U/g):诺维信;其余试剂均为国产分析纯。1.2仪器和检测方法WF180万能粉碎机:上海光学仪器厂;TU-1900紫外可见分光光度计:北京普析;TDL-40C低速大容量离心机:上海安亭;RE-2000A旋转蒸发器:上海亚荣;DX-II恒温磁力搅拌器:常州诺基;SHZ-D循环水式真空泵:河南新乡;SPH-211F恒温振荡器:上海世平;PHS-3C酸度计:上海雷磁;HH-601恒温水浴锅:上海新嘉;JA1003A电子精密天平:上海伦捷。2测试方法2.1虾头、尾及壳的制备新鲜螯虾沸水煮制2min后自然冷却,剥除虾仁和内脏,流水洗净虾头、尾及壳,避光、密封于-20℃备用。试验前用万能粉碎机粉碎后备用。2.2脂肪酶解柠檬准确称取一定质量粉碎后的虾壳样品,按比例加入一定pH的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液和脂肪酶,恒温振荡酶解一段时间,酶解结束后冰水浴冷却,离心分离取滤渣,反复水洗去除矿物质,碾碎后加入丙酮过夜,过滤后留上清液,丙酮定容至50mL2.3提取虾青素的测定2.3.1标准曲线的绘制分别吸取0,0.50,1.00,1.50,2.00和2.50mL1.0mg/mL虾青素标准溶液于比色管中,丙酮定容至50mL,混合均匀后在478nm波长下测定吸光度,以吸光度为纵坐标,虾青素标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线(图1)。由图1可知,虾青素在0~50μg/mL范围内线性回归方程y=0.0086x-0.0063,相关系数为0.9993,结果符合朗伯比尔定律,方程可用于虾青素提取量的测定。2.3.2样品测定吸取1.0mL丙酮溶解液置于50mL比色管中,按照2.3.1测定吸光度,根据标准曲线计算虾壳提取液中虾青素提取量。2.4脂肪酶分解条件的选择2.4.1脂肪酶添加量对虾青素酯水解效果的影响准确称取7份粉碎后的虾壳样品各5.0g,分别加入pH为5.0的缓冲溶液100mL,再分别加入0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6和0.7g脂肪酶(加酶量分别为2%,4%,6%,8%,10%,12%和14%),然后置于50℃的恒温振荡器中酶解5h,酶解结束后根据2.2进行分离、除杂和定容,并根据2.3进行虾青素提取量测定,以虾青素提取量为指标考察脂肪酶添加量对虾青素酯水解效果的影响。2.4.2酶解温度对虾青素酯水解效果的影响准确称取7份粉碎后的虾壳样品各5.0g,分别加入pH为5.0的缓冲溶液100mL和0.5g脂肪酶,然后分别置于20℃,30℃,40℃,50℃,60℃,70℃和80℃的恒温振荡器中酶解5h,酶解结束后根据2.2进行分离、除杂和定容,并根据2.3进行虾青素提取量测定,以虾青素提取量为指标考察酶解温度对虾青素酯水解效果的影响。2.4.3溶液ph对虾青素酯水解效果的影响准确称取7份粉碎后的虾壳样品各5.0g,依次加入pH为4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5和7.0的缓冲溶液100mL和0.5g脂肪酶,然后置于50℃的恒温振荡器中酶解5h,酶解结束后根据2.2进行分离、除杂和定容,并根据2.3进行虾青素提取量测定,以虾青素提取量为指标考察溶液pH对虾青素酯水解效果的影响。2.4.4酶解时间对虾青素酯水解效果的影响准确称取7份粉碎后的虾壳样品各5.0g,分别加入pH为5.5的缓冲溶液100mL和0.5g脂肪酶,然后置于55℃的恒温振荡器中分别酶解1,2,3,4,5,6和7h,酶解结束后根据2.2进行分离、除杂和定容,并根据2.3进行虾青素提取量测定,以虾青素提取量为指标考察酶解时间对虾青素酯水解效果的影响。2.5最佳酶分解条件的确定在单因素试验的基础上,以脂肪酶添加量、酶解温度、溶液pH及酶解时间为因素,采用L3结果与分析3.1虾青素酯酶分解条件的选择3.1.1酶添加量的影响由图2可知,虾青素提取量随脂肪酶添加量的增大先快速增加,后趋于平缓。这主要是因为酶解速度不仅取决于水解速度,还受酶活性中心与底物结合位点结合速度的影响。当底物充足而脂肪酶添加量较少时,酶分子通过较小距离的运动即可快速接触到底物结合位点,并迅速发生水解反应,因此反应速度很快;再少量添加酶,在底物仍然充足的情况下,底物与酶结合位点也成比例增加,因此速度基本呈线性增加;而当酶添加量过多时,底物结合位点趋于饱和,再添加多余的酶也不能与底物结合,因此也不会产生酶解速度的增加。由此可见,脂肪酶添加量以10%为宜。3.1.2温度对虾青素提取的影响由图3可知,在20℃~50℃范围内,随着酶解温度的提高,虾青素提取量快速增加,这主要是因为温度的增加不仅能加快底物和酶分子运动速度,增加酶活性中心与底物结合中心接触的几率,而且还能促进脂肪酶-底物四面体过渡态的快速解离3.1.3ph对脂肪酶活性的影响由图4可知,随着溶液pH的增加,虾青素提取量先快速增加后缓慢降低,并在pH接近5.5时达到最大值(80.52μg/g),这主要是因为脂肪酶为弱酸性酶类,最适pH为5.5~6.0,在该pH范围内,酶分子和底物分子均处于最佳电离状态,有利于二者的结合和催化反应的进行;当pH小于5.5或大于6.5时,溶液中过多的H3.1.4脂肪酶-内酰胺酶结构特征由图5可知,随着酶解时间的延长,虾青素提取量先快速增加,后趋于平缓。这可能是因为脂肪酶的催化活性中心部位被一个或多个α-螺旋片段遮盖(称为“盖子”结构),当脂肪酶处于油水两相界面时,盖子结构打开,活性中心露出,并深入油相界面与底物酯键结合形成脂肪酶-底物四面体过渡态,然后再快速分解为脂肪酸和产物3.2各因素作用的回归分析采用极差法对正交试验结果(表2)进行分析,以各因素的水平为横坐标,k值为纵坐标绘制各因素作用的直观分析图(见图6)。由表2中R值可以看出,各因素对结果的影响次序为D>A>C>B,即酶解时间对虾青素提取量的影响最大,脂肪酶添加量次之,酶解温度对虾青素提取量的影响最小。由表2中虾青素提取量水平对应的k值和图6中曲线的形状可以看出,试验的最佳组合A3.3虾青素提取量测定因为A由表3可知,在设定的酶解条件下,虾青素提取量较高(87.58μg/g)且稳定,平均得率超过正交试验最大值,具有可行性和实用价值。4