菌落总数与大肠菌群数测定

菌落总数与大肠菌群数测定菌落总数与大肠菌群数测定第1页主要内容水样采集与送检菌落总数测定大肠菌群测定MPN法原理（拓展内容）菌落总数与大肠菌群数测定第2页水样采集和送检采样瓶：洗净、包扎、灭菌自来水：烧灼龙头，放水5-10min中和余氯：每500ml水样，预加1.5%Na2S2O32ml水源水：距水面10-15cm送检时间：<=2h(常温)，<=4h(冷藏)菌落总数与大肠菌群数测定第3页采样瓶菌落总数与大肠菌群数测定第4页烧灼水龙头菌落总数与大肠菌群数测定第5页菌落总数测定试验目标掌握菌落总数测定方法试验原理 不一样稀释度水样，营养琼脂培养基，37℃，24h，菌落数菌落总数与大肠菌群数测定第6页菌落总数测定器材与试剂：水样，无菌蒸馏水，营养琼脂培养基，1ml吸管，10ml吸管，平皿菌落总数与大肠菌群数测定第7页菌落总数测定试验步骤

1.稀释水样：

10ml水样加入90ml无菌蒸馏水、振荡、彻底混匀

2.做1：10系列稀释三支9ml无菌蒸馏水试管

3.倾注培养

1ml稀释水样、15ml培养基（45℃）

4.倒置培养：37℃，24h菌落总数与大肠菌群数测定第8页倾注培养菌落总数与大肠菌群数测定第9页培养结果菌落总数与大肠菌群数测定第10页菌落总数测定试验步骤

5.菌落计数：肉眼观察，可用放大镜，可标识必要时分区计数，菌落成片者作废计算方法某稀释度菌落数：两平板菌落数取平均值选择菌落数在30-300之间稀释度（1）仅有一个稀释度在此范围：菌落数×稀释倍数菌落总数与大肠菌群数测定第11页菌落总数测定计算方法：（2）有两个稀释度在30-300之间菌落数之比>2，选较小值菌落数之比<2，取平均值（3）全部稀释度均>300

取稀释倍数最大者（4）全部稀释度均<30

取稀释倍数最小者（5）没有任何稀释度在30-300之间选最靠近该范围者结果单位：CFU/ml菌落总数与大肠菌群数测定第12页菌落总数测定注意事项：

1.无菌操作

2.标识

3.何时更换吸管

4.吸吹混匀

5.琼脂培养基保温

6.安全常识菌落总数与大肠菌群数测定第13页大肠菌群数测定试验目标试验原理

37℃，24h，乳糖，产酸（溴甲酚紫），产气（小倒管）三步法：初发酵、分离培养、复发酵器材与试剂水样、无菌蒸馏水、乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基，革兰染液

1ml吸管、10ml吸管、试管、平皿、载玻片菌落总数与大肠菌群数测定第14页初发酵器材与试剂水样、90ml无菌水、9ml无菌水、5ml三倍乳糖蛋白胨，10ml吸管、1ml吸管、酒精灯、吸球菌落总数与大肠菌群数测定第15页大肠菌群数测定试验步骤：

1.初发酵（1）10ml水样+3倍乳糖蛋白胨培养液（5ml）（2）三个稀释度（原水样，1:10和1：100），各取1ml+乳糖蛋白胨培养液（10ml）（3）培养：37℃，24h

（4）观察指标：产酸（黄色），产气（倒管内有气泡）菌落总数与大肠菌群数测定第16页吸收水样菌落总数与大肠菌群数测定第17页加注水样菌落总数与大肠菌群数测定第18页初发酵结果左2为阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生。菌落总数与大肠菌群数测定第19页大肠菌群数测定试验步骤

2.分离培养（1）制备伊红美蓝平板：

45℃，无菌，倾注，15ml

（2）选产酸产气发酵管（3）接种至伊红美蓝平板分区划线法（4）培养：37℃，24h菌落总数与大肠菌群数测定第20页分离培养器材与试剂初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基菌落总数与大肠菌群数测定第21页分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环菌落总数与大肠菌群数测定第22页分区划线法操作关键点

1.划下一个区前必须灭菌接种环

2.划线时接种环同平板呈30-40°角

3.每次划线应该压到上一个区域2-3条线

4.用接种环“面”而不是“弧”在平板上滑动菌落总数与大肠菌群数测定第23页大肠菌群数测定试验步骤

2.分离培养：

（5）菌落特征：深紫黑色、有金属光泽紫黑色、无或略有金属光泽淡紫红色、中心颜色深（6）革兰染色、镜检：选特征菌落菌落总数与大肠菌群数测定第24页革兰染色法器材与试剂结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸菌落总数与大肠菌群数测定第25页革兰染色法涂片：接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀热固定：经过火焰若干次初染：结晶紫一滴，1min，水洗媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗脱色：95%乙醇，30s或至无色为止复染：复红一滴，30s菌落总数与大肠菌群数测定第26页涂片菌落总数与大肠菌群数测定第27页热固定菌落总数与大肠菌群数测定第28页初染菌落总数与大肠菌群数测定第29页媒染菌落总数与大肠菌群数测定第30页脱色菌落总数与大肠菌群数测定第31页复染菌落总数与大肠菌群数测定第32页革兰氏染色阴性革兰氏染色阳性革兰染色法菌落总数与大肠菌群数测定第33页复发酵器材与试剂培养24小时后伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管菌落总数与大肠菌群数测定第34页大肠菌群数测定试验步骤

3.复发酵（1）选取判定为无芽孢G-杆菌菌落1-3个（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液（3）培养：37℃，24h

（4）观察指标：产酸，产气菌落总数与大肠菌群数测定第35页液体接种菌落总数与大肠菌群数测定第36页复发酵复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生菌落总数与大肠菌群数测定第37页大肠菌群数测定注意事项：

1.无菌操作

2.吸管使用

3.洗去染液方法

4.显微镜保养

5.液体接种菌落总数与大肠菌群数测定第38页MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）目标：对某种细菌进行选择性计数关键思想：泊松分布实施方法：屡次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，依据阳性管数估算MPN值菌落总数与大肠菌群数测定第39页MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）1.细菌进入发酵管概率近似服从泊松分布:P(x=k)=e-x×xk/k!x:细菌浓度，k:进入发酵管细菌数2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生概率为：

其中C为常系数

V为总水样量，x为细菌个数菌落总数与大肠菌群数测定第40页MPN法原理3.当y(x)max，XMPN4.因为y(x)为单极值函数，令dy/dx=0,即5.解此方程，得x=MPN6.该方程为超越方程，普通采取数值法求近似解7.日常试验时采取查表法推算MPN值。8.表格在教材第260-261页。菌落总数与大肠菌群数测定第41页饮用水卫生标准菌落总数：不超出100CFU/ml大肠菌群：不得检出引自GB/T5750-菌落总数与大肠菌群数测定第42页参考资料张朝武.卫生微生物