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文档简介
蛋白质工程专业讲座蛋白质工程专业讲座第1页蛋白质功效与结构蛋白质工程诞生蛋白质工程基础步骤和改造方法食物蛋白质改性技术蛋白质工程在食品产业中应用蛋白质工程专业讲座第2页一、蛋白质功效与结构1.1蛋白质功效1.2蛋白质结构蛋白质工程专业讲座第3页1.1蛋白质功效(1)蛋白质是组成生命主要物质之一蛋白质是一类主要而复杂生物大分子,它广泛地存在于全部生物界机体之中,含有许多主要作用;生物体新陈代谢几乎全部化学反应都是在活性蛋白质-酶催化下进行;高等动物免疫反应,主要是经过蛋白质,即抗原和抗体完成;运动时肌肉收缩靠是一些蛋白质相互作用来完成;运输氧和二氧化碳是血红蛋白;含有代谢和调整功效是各种蛋白质激素。蛋白质工程专业讲座第4页(2)蛋白质应用蛋白质是人类赖以维持生命主要营养起源之一。用蛋白质诊疗和治疗一些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于帮助消化,治疗消化不良性疾病;胰岛素用于治疗严重糖尿病;转氨酶作为肝病变指标等。食品工业中主要应用蛋白质或利用蛋白质性质制造各种产品。比如,酿造业要用蛋白酶来增加酱油鲜味等(texture)。蛋白质工程专业讲座第5页1.2蛋白质结构氨基酸是蛋白质基础结构单位,各种氨基酸之间经过肽键彼此按直线形头尾相连,组成不一样长短肽链。肽键形成蛋白质工程专业讲座第6页肽链又以一定方式折叠盘绕成独特空间结构,这时才产生含有生物活性天然蛋白质。多肽链折叠可分为四种不一样层次结构。一级结构:仅指肽链中氨基酸线型排列次序,不考虑空间排列。牛胰岛素氨基酸序列蛋白质工程专业讲座第7页二级结构:主链原子局部空间排列,不包含侧链构象和与其它链段相互关系,如
-螺旋、
-折叠等主链构象单元就是二级结构。
-螺旋
-折叠蛋白质工程专业讲座第8页三级结构:蛋白质多肽链在各种二级结构基础上再深入盘曲或折叠形成含有一定规律三维空间结构。
碳酸酐酶多肽骨架示意图蛋白质工程专业讲座第9页四级结构:含有二条或二条以上独立三级结构多肽链组成蛋白质,其多肽链间经过次级键相互组合而形成空间结构。其中,每个含有独立三级结构多肽链单位称为亚基。四级结构实际上是指亚基立体排布、相互作用及接触部位布局。如血红蛋白分子中四个亚基之间空间关系。血红蛋白结构蛋白质工程专业讲座第10页二、蛋白质工程诞生蛋白质工程是指基于蛋白质结构功效研究结果,经过基因工程技术,改造现有蛋白质和设计制造新蛋白质,因而也称为第二代基因工程。蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科基础之上,融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来新兴研究领域。蛋白质工程专业讲座第11页内容主要有两个方面:依据需要合成特定氨基酸序列和空间结构蛋白质;确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功效之间关系;在此基础之上,实现从氨基酸序列预测蛋白质空间结构和生物功效,设计合成含有特定生物功效全新蛋白质,这也是蛋白质工程最根本目标之一。蛋白质工程专业讲座第12页生物理论和技术在以下九方面发展促进了蛋白质工程诞生:①新克隆技术,尤其是完整cDNA克隆技术;②快速测定DNA序列方法;③从DNA序列推算蛋白质序列计算机程序系统;④蛋白质序列数据库建立,使一级结构相同蛋白质能被很快地判定出来,由此研究其功效上相同性;蛋白质工程专业讲座第13页⑤对原核生物和真核生物基因表示调控深入深入了解;⑥用于基因体外诱变化学、酶学和合成技术进展;蛋白质工程专业讲座第14页三、蛋白质工程基础步骤和改造方法3.1蛋白质工程研究基础步骤3.2蛋白质改造方法蛋白质工程专业讲座第15页3.1蛋白质工程研究基础步骤分离纯化目标蛋白,使之结晶,并作X晶体衍射分析,结合核磁共振等其它方法分析结果,得到其空间结构尽可能多信息;对目标蛋白功效作详尽研究,确定它功效域;经过对蛋白质一级结构、空间结构和功效之间相互关系分析,找出关键基团和结构;借助于计算机图像显示和分子辅助设计,提出对目标蛋白分子改建或构建方案,并用基因工程方法去实施;蛋白质工程专业讲座第16页3.2.2合成全新蛋白质基于天然蛋白质结构改造蛋白质工程能够优化蛋白质活性,而全新蛋白质设计是合成含有新奇结构与功效新蛋白质。蛋白质工程专业讲座第17页从头设计一个蛋白质基础步骤:构建一个多肽链骨架模型从已知三维结构数据库中挑选出一个适当片段,进行修改和组合依据氨基酸残基统计学数据和排列优先次序,确定每个残基位置上氨基酸优化目标蛋白三维模型检验和考评所给定目标蛋白质结构是否合理,对所设计模型做深入修正几轮设计、检验和再设计,取得一个正确折叠和带有大家预期功效目标蛋白质蛋白质工程专业讲座第18页四食物蛋白质改性技术伴随食品工业飞速发展,迫切需要大量含有功效特征和营养特征蛋白质,作为食品原料成份或添加基料;大力开发含有优良特征蛋白质资源;对现有蛋白质进行改性,以满足大家特殊需求;人类食用蛋白质主要有两大类,植物蛋白和动物蛋白植物蛋白周期短,资源丰富,产量大等优点,在食用蛋白中占70%以上,而动物蛋白则不足30%。蛋白质工程专业讲座第19页蛋白质是由各种氨基酸相互联结而组成含有空间结构生物大分子。其理化性质(尤其分子量、氨基酸组成、静电荷和表面疏水性)与功效特征直接相关。蛋白质改性就是用生化原因(如化学试剂、酶制剂等)或物理原因(如热、射线、机械振荡等)使其氨基酸残基和多肽链发生某种改变,引发蛋白大分子空间结构和理化性质改变,从而取得很好功效特征和营养特征蛋白质。蛋白质工程专业讲座第20页序号教学内容(按章填写)课时课堂
讲授实验课习题课讨论课其他1第一章绪论4
2第二章基因工程原理及其在食品工业中应用10
3第三章发酵工程原理及其在食品工业中应用8
4第四章酶工程原理及其在食品工业中应用8
小计30
百分比100%
累计30蛋白质工程专业讲座第21页磷酸化作用磷酸化改性后蛋白中,因为引进大量磷酸根基团,从而增加蛋白质体系电负性,提升蛋白质分子之间静电斥力,使之在食品体系中更易分散,相互排斥,因而提升溶解度,聚集稳定性,降低等电点,而且其净电荷只有在相当低环境中才会被中和,故可有效拓宽在食品中应用范围。磷酸化改性蛋白因为负电荷引入,大大降低乳状液表面张力,使之更易形成乳状液滴,同时也增加液滴之间斥力,从而更易分散,所以改性蛋白乳化能力及乳化稳定性都有较大改进。蛋白质工程专业讲座第22页糖基化作用将碳水化合物以共价键与蛋白质分子上氨基或羧基相结合化学反应(包含美拉德反应),为蛋白质糖基化作用;提升蛋白质功效特征。普通来说,合成糖基化蛋白在较低离子强度或天然蛋白等电点处仍表现出较高溶解性;糖基化提升蛋白质热稳定性,且伴随糖基化程度提升,糖基化蛋白质功效特征也随之提升。蛋白质工程专业讲座第23页蛋白水解作用采取蛋白酶对蛋白质进行轻微水解,可显著提升蛋白质溶解性能,改进表面/界面性质,水解使蛋白质柔性增大,易于在表面吸附,增强乳化性及起泡能力。蛋白质水解可能产生免疫调整肽、血管担心素I转化酶抑制肽、丝氨酸磷酸肽,它们存在于食品蛋白质氨基酸序列中,为非活性状态,但在消化道被释放出来,成为生理调整因子,为食品蛋白质营养价值增添新内涵。蛋白质工程专业讲座第24页物理改性物理改性是利用热能、机械能、声波能等进行蛋白质改性方法;当前较为集中在热变性和挤压蒸煮过程研究;温度升高对蛋白质中许多化学键都有所影响,故热处理要提升疏水性,同时蛋白质不会发生聚集沉淀。挤压组织化就是在高温、高压及高剪切作用条件下,蛋白质结构展开,分子重新排列。挤压引发蛋白质生物价降低要比其它形式热处理为大蛋白质工程专业讲座第25页五、蛋白质工程在食品产业中应用在实际生产中,能够应用蛋白质工程对生产中主要酶或蛋白质性质加以改造,提升现有酶或蛋白质工业实用性:提升酶热稳定性(引入二硫键,改进酶热稳定性)。改变酶最适pH值条件;提升酶催化活性;蛋白质工程专业讲座第26页溶菌酶是一个广泛应用于食品工业酶制剂,其催化速率随温度升高而升高,所以,它热稳定性是提升其应用潜力主要标准。蛋白质晶体结构研究表明,T4溶菌酶分子一个主要特征是在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键半胱氨酸,所以,构想经过在分子中增加一对或数对二硫键,来提升酶热稳定性。采取定位突变技术使该菌肽链第9位和第164位氨基酸残基转变为半胱氨酸,并形成一对二硫键,取得突变体酶活性高于天然酶6%,熔点温度提升6.4度;新引入“工程二硫键”能够稳定两个结构域之间相对位置,进而稳定了由两个结构域所形成活性中心。蛋白质工程专业讲座第27页纤维素酶是一类水解纤维素中β-1,4-葡萄糖苷键糖苷水解酶。依据氨基酸序列相关性,糖苷水解酶可分为82个家族,其中纤维素酶占其中13个家族。纤维素酶依据其催化功效不一样,又可分为内切葡萄糖苷酶、外切葡萄糖苷酶和纤维二糖酶。自1904年在蜗牛消化液中发觉纤维素酶至今已经有100多年。对纤维素酶研究分三个阶段:第一个阶段是1980年以前,主要工作是利用生物化学方法对纤维素酶进行分离纯化;第二个阶段是从1980年到1988年,主要工作是利用基因工程方法对纤维素酶基因进行克隆和一级结构测定;第三阶段是从1988年至今,主要工作是利用蛋白质工程方法对纤维素酶结构域拆分、解析、功效氨基酸确实定、水解双置换机制确实定、分子折叠和催化机制关系探讨。蛋白质工程专业讲座第28页蛋白质工程工作:对潜在活性中心氨基酸残基进行基因定点突变;体外分子定向进化;对定点突变酶进行动力学分析;通常是用基因定点突变技术对经典纤维素酶家族序列不变残基确实认和三维构象确实认,并经过设计新三维复合体来对酶进行修整和探索。迄今为止,纤维素酶已经有10个家族(第5、6、7、8、9、12、26、44、45、48家族)被克隆出来,其中第5、6、7、8、9、45家族已经用蛋白质工程技术进行了研究。蛋白质工程专业讲座第29页微生物脂肪酶是一类能催化水解、酯化、酯交换、转酯、醇解、酸解以及氨解反应等各种化学反应工业生物催化剂。脂肪酶催化化学反应含有化学选择、立体选择性、位点选择性、催化活性高而副反应少、催化反应又不需要辅助因子等特点广泛应用于食品加工、油脂加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学、化装品、杀虫剂、生物柴油、去污剂、皮革加工、造纸、生物修复、医药、精细化工、去污剂添加剂、造纸、皮革等很多工业领域;蛋白质工程专业讲座第30页市场需求量大(仅洗涤剂添加剂一项,每年市场需求量就高达1000吨),是大宗工业用酶制剂之一;脂肪酶催化化学反应工艺条件,通常是在各种有机溶剂介质(如生物柴油生产中使用短链醇)、极端酸碱(如废纸脱墨工业中强碱性)等条件下,轻易造成天然脂肪酶失活,生产成本升高,从而限制了脂肪酶大规模应用。蛋白质工程专业讲座第31页当前主要有两条路径提升脂肪酶对各种极端工艺条件耐受性:从极端环境微生物中筛选新型能耐受极端工艺条件脂肪酶利用蛋白质工程技术改造和优化现有脂肪酶分子性能。极端微生物培养条件苛刻,极端微生物产生极端脂肪酶更含有不确定性(许多极端微生物产生脂肪酶并不属于极端脂肪酶),而且开发这类极端脂肪酶周期长,花费昂贵。越来越多脂肪酶3D结构说明,结合生物信息学,利用蛋白质工程技术,快速设计和改造现有脂肪酶分子,取得新型高活性和高稳定性脂肪酶分子,已经有许多成功报道。脂肪酶蛋白质工程技术包含脂肪酶化学修饰和脂肪酶分子进化两种方式。蛋白质工程专业讲座第32页脂肪酶化学修饰双功效聚合物化学修饰双功效聚合物化学修饰是指利用双功效聚合物如戊二醛等将酶蛋白分子之间、亚基之间或在分子内不一样肽链之间,共价交联形成交联酶晶体,从而提升酶稳定性。用戊二醛制备洋葱假单胞菌脂肪酶交联酶晶体,其转酯活性提升了12倍。单功效聚合物化学修饰单功效聚合物化学修饰是将多糖或多聚物如PEG及其衍生物等活化后,与脂肪酶侧链氨基相互作用,从而将其偶联到酶分子上。用多糖偶联C.antarctica(南极洲念珠菌)脂肪酶B后,70℃半衰期由18min提升到168min。蛋白质工程专业讲座第33页小分子修饰法
小分子修饰法是利用小分子化合物如醛、酮、羧酸、脂肪酸等与脂肪酶表面暴露游离羟基、酚羟基、巯基、羧基、氨基等基团反应,从而改变脂肪酶酶学性质。
利用脂肪酸修饰C.viscosum(染色粘性菌)脂肪酶,该酶酯交换活性从0mmol/(h·g)提升到270mmol/(h·g)。蛋白质工程专业讲座第34页蛋白质工程专业讲座第35页脂肪酶分子进化分子进化是在分子水平上应用基因工程伎俩对脂肪酶进行有针正确设计或定向加工,以提升脂肪酶活性和稳定性,或者创造出含有新功效脂肪酶。分子进化方法主要有理性设计、定向进化及各种突变技术结合。利用分子进化技术,提升微生物脂肪酶稳定性,优化脂肪酶催化活性,取得了巨大成功。蛋白质工程专业讲座第36页理性设计理性设计是依据已知脂肪酶三维结构,利用生物信息学(如动力学模拟)分析脂肪酶蛋白分子结构和功效关系,确定能够替换或修饰氨基酸残基、替换氨基酸残基类型、侧链修饰对脂肪酶催化性能影响,然后利用定点突变技术完成氨基酸残基替换。利用分子动力学模拟技术结合定点突变技术,C.antarctica脂肪酶B活性中心色氨酸残基突变为丙氨酸残基,有效地扩充了脂肪酶活性中心空间,对仲醇催化活性提升了270倍。蛋白质工程专业讲座第37页定向进化(自然选择)常见定向进化方法包含两大类:随机突变和基因重组随机突变技术包含致错PCR、单分子PCR、化学诱变剂介导随机诱变、致突变菌株产生随机突变等;基因重组技术包含DNA改组,随机引物体外重组,交织延伸重组等。
蛋白质工程专业讲座第38页随机突变致错PCR技术
致错技术是依据TaqDNA聚合酶缺乏校正功效,在PCR扩增过程中存在一定频率碱基错配特点而开发出来随机突变技术。利用致错PCR技术对R.niveus(红泡刺藤)脂肪酶分子定向进化,筛选到一个脂肪酶突变体最适温度比野生脂肪酶最适温度提升了15℃。致错PCR技术即使操作简便快速,但只能产生点突变突变体,而且有益突变频率低。蛋白质工程专业讲座第39页单分子PCR技术单分子PCR技术是一个在极端条件下含有高度错配倾向PCR技术,其碱基错配频率为普通Taq酶三倍,达2.5×10-5/碱基/循环。Kato应用单分子PCR技术体外进化B.cepacia(洋葱伯克霍尔德菌)脂肪酶对映体拆分活性,筛选到脂肪酶突变体对映体拆分活性提升了42倍。蛋白质工程专业讲座第40页基因重组DNA改组技术:以经过多代诱变碱性脂肪酶产生菌扩展青霉FS8486菌株和分离自新疆火焰山口土样溜曲霉FS-132菌株作为原始出发菌株,经过两轮基因组改组,得到脂肪酶产量提升了3.2倍突变体。蛋白质工程专业讲座第41页各种突变技术混合体系:每种体外进化技术,都有其本身缺点和不足,经过各种体外进化方法组合,能够有效克服技术上不足,提升阳性突变频率。利用致错PCR技术和DNA改组技术快速筛选到一个R.arrhizus(少根根霉)脂肪酶突变体,其温度稳定性较天然脂肪酶提升了12倍。蛋白质工程专业讲座第42页蛋白质工程专业讲座第43页植酸酶可将植物性饲料中植酸及其盐分解为肌醇和磷酸,增加可利用磷含量,降低植酸对矿物质和蛋白质亲和力,解除植酸抗营养作用,从而增加动物对蛋白质和一些金属离子吸收能力。植酸酶在饲料中推广和应用还相当有限,主要原因:(l)植酸酶在天然材料中含量太低,难以大量生产;(2)植酸酶热不稳定性不能完全满足饲料加工、贮藏、使用要求。当前,用蛋白质工程伎俩在提升饲用植酸酶表示量,改进热稳定性和改良植酸酶催化性质等方面已取得较大进展。蛋白质工程专业讲座第44页植酸酶改性策略要取得含有新功效和特征酶方法有两种:从大量自然存在微生物中筛选能够产生期望性质酶,经过基因工程技术,在适合宿主中表示。利用蛋白质工程对已存在酶DNA或氨基酸序列进行修饰改造。蛋白质工程专业讲座第45页定点突变提升植酸酶表示量植酸酶生产菌株表示量低,难以取得大量产品,使生产成本太高,利用高效表示系统作为生物反应器,大规模低成当地大量生产植酸酶,无疑是处理这一问题行之有效方法之一。利用毕赤酵母表示植酸酶能够取得大量产品,表示量由原始菌株每毫升几微克提升到1-10毫克,并能在酵母中进行糖基化修饰等蛋白质翻译后加工,提升酶生物活性。
蛋白质工程专业讲座第46页为了提升植酸酶在酵母中表示率,可经过定点突变将个别在毕赤酵母中低偏爱性密码子替换为高偏爱性密码子。姚斌等对在毕赤酵母中表示植酸酶基因phyA2进行了Arg密码子优化突变,将4个Arg密码子(有3个编码Arg密码子是CGG,1个是CGA)突变成高频使用AGA,Arg密码子优化后其表示量可达每毫升培养液15000u,比Arg秘密子没有优化表示量提升了近37倍。蛋白质工程专业讲座
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