SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第1页试验目标学习SDS测定蛋白质分子量原理掌握垂直板电泳操作方法。利用SDS测定蛋白质分子量及染色判定。SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第2页试验流程配胶样品制备电泳（1.5~2h）染色（20min）脱色（30min~2h）分析配分离胶(下胶)配浓缩胶(上胶)SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第3页实验过程1.装配装置BG-verMINI型迷你垂直电泳槽(北京百晶)SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第4页2.凝胶配制

实验过程*Acr有神经毒性下胶(分离胶)10%上胶(浓缩胶)5%H2O3.9ml3.4ml30%Acr-Bis3.3ml0.83mlBuffer(含SDS)(1.5MTris-ClpH8.8)2.6ml(1MTris-ClpH6.8)0.68ml10%APS200ml100mlTEMED10ml10mlTOTAL10ml5mlSDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第5页实验过程3.灌胶※凝胶配制过程要快速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,不然凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,防止产生气泡.1cm下胶高度，距齿下1cmAB

水封平齐，排气泡加速聚合C弃水层凝固D灌上胶，插梳子梳需平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第6页加入分离胶溶液pH8.8封水或饱和正丁醇溶液出现显著界面时，分离胶凝聚完成（10~20min）倒出水或正丁醇，并用加样枪/滤纸吸干制备分离胶(下胶)

封水目标是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好标志是胶与水层之间形成清楚界面。SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第7页分离胶pH8.8加入浓缩胶溶液pH6.8制备浓缩胶(浓缩胶)样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。插入样品梳SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第8页1.SDS2.

-mercaptoethanol

3.bromophenolblue4.GlycerolSamplebuffer样品处理ssSHSH金属浴(100℃)中15minSamplebufferSDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第9页实验过程4.上样、电泳A.样品加热，上样B.电泳+（1）上胶恒压80V(8V/cm)（2）下胶恒压120V(12V/cm)SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第10页加入电极缓冲液pH8.3浓缩胶pH6.8通电分离胶pH8.8加入样品上样及电泳开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停顿电泳。SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第11页StakinggelSeparatinggelSDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第12页电流路径

负极正极内槽外槽凝胶外槽————SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第13页实验过程5.染色、脱色染色20分钟B.脱色30分钟至2小时考马斯亮兰R250SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第14页蛋白质染色方法氨基黑

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳考马斯亮兰R-250，G250

G250测定蛋白含量银染

敏感度最高，常应用于蛋白质双向电泳SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第15页聚合原理()n()n()n()n()n+*Acr有神经毒性n决定了交联度与浓度一起决定孔径大小过硫酸铵是催化剂TEMED是加速剂蛋白质是29：1核酸是19：1SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第16页实验原理1、带电质点在电场中向带有异相电荷电极移动，这种现象称为电泳。电荷

分子大小分子形状SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第17页实验原理浓缩效应Cl-Gly-Cl-Gly-Cl-Gly-PH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Gly-Gly-Pr-Pr-Pr-PH8.8SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第18页Pr为何带负电加样缓冲液二硫键盐键疏水作用氢键巯基乙醇断二硫键SDS断化学键带负电荷甘油SDS：Pr=1.4:1NC氨基酸侧链SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-促沉溴酚兰Tris?SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第19页实验原理浓缩效应Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Pr-Pr-Pr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.8快慢离子产生高电压梯度Pr-运动加速SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第20页实验原理浓缩效应Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.85%10%快慢离子产生高电压梯度Pr-运动加速浓缩效应SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第21页SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第22页实验原理分子筛效应pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子pH8.85%10%甘氨酸解离增加无快慢离子Pr-依据分子量运动分子筛效应Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第23页实验原理分子筛效应pH6.8主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子pH8.85%10%甘氨酸解离增加无快慢离子Pr-依据分子量运动分子筛效应Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第24页实验原理分子筛效应pH6.8pH8.85%10%lgMw电泳迁移率lgMw=-bx+KPrMw在11.7-165KdSDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第25页实验原理分子筛效应pH6.8pH8.85%10%迁移率=蛋白质移动距离脱色后胶长染色前胶长指示剂移动距离SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第26页实验原理迁移率=“蛋白质移动距离”指示剂移动距离染色前染色后蛋白质带在哪呢？L1L2L3L4LxL1XL3L2XL4SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第27页PageRulerPrestainedProteinLadder

AprestainedSDSMWmarkerwithcontrastingcoloredreferencebandsat10and70kDa.SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第28页注意事项采取此法测蛋白质分子量时，必须完全打开二硫键。多亚基蛋白问题有些蛋白质不能用SDS测定分子量。如电荷异常或构象异常蛋白质，带有较大辅基蛋白质（一些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第29页思索题在不连续体系SDS中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为何?电极缓冲液中甘氨酸作用?在不连续体系SDS中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第30页976644292014MarkerSDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第31页Tanon-1600数码凝胶图像分析系统GIS1D图像分析软件(Ver.4.00)SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第32页诱导前后蛋白表示差异IPTG诱导表示His-GFP融和蛋白（31.9kD）。1为诱导前，2～6分别为诱导0.5,1,1.5,2,2.5hrs。SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第33页电泳过程中不正常现象1“微笑”现象指示剂前沿展现两边向上曲线形，主要是因为凝胶中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚凝胶中。处理方法：待其充分凝固再作后续试验。SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第34页2皱眉现象

因为垂直电泳槽装置不适当引发，尤其是当明胶和玻璃板组成“三明治底部有气泡”或靠近隔片凝胶聚合不完全处理方法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第35页3“拖尾”现象样品溶解不佳引发或分离胶浓度过大

处理方法：加样前离心选择适当样品缓冲液和凝胶缓冲液加增溶试剂降低凝胶浓度SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第36页4“纹理”现象样品中不溶性颗粒引发处理方法：增加溶解度离心除去不溶性颗粒SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第37页5偏斜现象电极放置不平行或加样位置偏斜引发SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第38页6-2整块胶分离条带太宽

主要是未浓缩好原因处理方法：适当增加浓缩胶长度；确保浓缩胶贮液pH正确（6.7）；适当降低电压；6-1某一条泳道条带太宽加样量太多或者加样孔泄露引发SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第39页7.“鬼带”

“鬼带”就是在跑大分子、构象复杂蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要因为还原剂在加热过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同免疫学活性，WB反应中可见其能与目标条带对应抗体作用。处理方法：在加热煮沸后，再添加适量DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂氧化。SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第40页谢谢!SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第41页附：蛋白质提取与定量方法蛋白质提取不一样起源，不一样方法SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第42页提取原则细胞破碎适当裂解液普通在冰上进行加入适当蛋白酶抑制剂SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第43页哺乳类细胞裂解液-RIPA50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40（乙基苯基聚乙二醇，惯用非离子性去垢剂）,0.1%SDSSDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第44页蛋白酶抑制剂抑制剂靶蛋白酶PMSF苯甲基磺酰氟丝氨酸蛋白酶EDTA金属蛋白酶Leupeptin亮肽素丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶Aprotinin抑肽酶胰蛋白酶及糜蛋白酶Pepstatin抑肽素天冬氨酸蛋白酶SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第45页定量方法紫外吸收法BCA法Lowry法Bradford法SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第46页以双缩脲为基础方法1.BCA法bicinchoninicacid二奎啉甲酸法SDSPAGE蛋白凝胶电泳专家讲座第47页以双缩脲为基础方法2.lowry法

folin酚法磷钨酸和磷钼酸钨蓝、钼蓝BCA和Lowry法比双缩脲灵敏高100倍

0.005-0.10mg/ml

SDSPAGE蛋