提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定

一、试验目标1、学习和掌握电泳（PAGE和SDS）基本原理及电泳技术。2、熟练掌握SDS相关试剂配制技术。3、了解SDS垂直板电泳法基本原理及操作技术。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第1页二、试验原理电泳概念：带电粒子在电场中向与其本身带相反电荷电极移动，这种现象称为电泳(electrophoresis，简称EP)。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高分辨率，当前已成为生物科学研究中必不可少伎俩之一。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第2页影响电泳主要原因

影响泳动速度原因：（1）颗粒性质：普通说来，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越靠近球形，在电场中泳动速度就快。反之，则越慢。（2）电场强度：电场强度越高，带电颗粒泳动速度越快。反之，则越慢。（3）pH值：对蛋白质而言，溶液pH值离其等电点愈远，其带净电荷量就愈大，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第3页（4）离子强度：溶液离子强度普通在0.02～0.2mol/kg之间电泳较适当。若离子强度过高，则会降低颗粒泳动度。其原因：带电颗粒能把溶液中与其电荷相反离子吸引在自己周围形成离子扩散层。这种静电作用结果，造成颗粒泳动速度降低，则缓冲能力差，往往会因溶液pH值改变而影响泳动速率。（5）溶液粘度：泳动度与溶液粘度是成反百分比关系。所以，粘度过大或过小，必定影响泳动速度。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第4页（6）电渗：当支持物不是绝对惰性物质时，经常会有离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中正离子，使靠近支持物溶液相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物离子基团吸附溶液中负离子，则溶液层会向正极移动。溶液泳动现象称为电渗。当颗粒泳动方向与电渗方向一致时，则加紧颗粒泳动速度；当颗粒泳动方向与电渗方向相反时则降低颗粒泳动速度。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第5页（7）焦耳热：电泳过程中释放热量与电流强度平方成正比。当电流强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会伴随增大。这不但降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或融化琼脂糖凝胶支持物。（8）筛孔：支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等筛孔，在筛孔大凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳动速度慢。除上述影响泳动速度因子外，温度和仪器装置等因子影响也应考虑。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第6页聚丙烯酰胺凝胶电泳：是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体一个区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺(N，Nˊ-methylenabisacrylamide，简称Bis)，在催化剂作用下聚合而成。Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定，但在含有自由基团体系时，它们就聚合。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第7页聚丙烯酰胺凝胶聚合体系有两种，化学聚合和光聚合。化学聚合：引发剂是过硫酸铵[(NH4)2S2O3](简称Ap)，催化剂是N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，简称TEMED)。在催化剂TEMED作用下，由过硫酸铵(Ap)形成氧自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第8页TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟。冷却（低温）也可使聚合速度变慢。一些金属抑制聚合，分子氧阻止链延长，妨碍聚合作用。这些原因在实际操作时都应给予控制。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第9页光聚合：以光敏感物核黄素(即VB2)作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引发聚合作用。过量氧会阻止链长增加，应防止过量氧存在。光聚合形成凝胶孔径较大，而且伴随时间延长而逐步变小，不太稳定，所以用它制备大孔径浓缩胶较为适当。采取化学聚合形成凝胶孔径较小，而且重复性好，惯用来制备分离胶。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第10页聚丙烯酰胺基本结构为丙烯酰胺单位组成长链，链与链之间经过甲叉桥联结在一起。链间纵横交织，形成三维网状结构，使凝胶含有分子筛性能。网状结构还能限制蛋白质等样品扩散运动，使凝胶含有良好抗对流作用。另外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺尤其适于作区带电泳支持介质。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第11页聚丙烯酰胺凝胶质量主要由凝胶浓度和交联度决定。凝胶浓度：用T％表示每100mL凝胶溶液中含有单体(Acr)和交联剂(Bis)总克数。交联度：用C％表示凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量百分数。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第12页凝胶浓度(T)选择与被分离物质分子量亲密相关。表3.4分子量范围与凝胶浓度关系分子量范围 适用凝胶浓度/(%)

蛋白质

104 20-30 1-4×104 15-20

1-5×104-1×105 10-15

1×105 5-10

5×105 2-5 核酸(RNA)

104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第13页改变凝胶浓度(T％)和交联度(C％)，可取得不一样密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小凝胶，方便适应各种样品分离。普通惯用7.5％浓度聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，用2.4％分离核酸。但依据蛋白质与核酸分子量不一样，适用浓度也不一样。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第14页聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamidegelelectrophoresis，简称PAGE）依据其有没有浓缩效应分为连续、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳连续聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中，缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下主要有电荷及分子筛效应。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第15页不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中，因为缓冲液离子成份、pH、凝胶浓度及电位梯度不连续性，带电颗粒在电场中泳动不但有电荷效应、分子筛效应还含有浓缩效应。下面就这三种物理效应分别加以说明。(l)电荷效应：各种样品分子按其所带电荷种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第16页(2)分子筛效应：分子量或分子大小和形状不一样样品分子，经过一定孔径分离胶时，受妨碍程度不一样而表现出不一样迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，形状为球形分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快。分子量大，形状不规则分子，电泳过程中受到阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中情况不一样。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第17页(3)浓缩效应：待分离样品中各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀样品得到高度浓缩。其原因以下：①因为两层凝胶孔径不一样，样品向下移动到两层凝胶接口时，阻力突然加大，速度变慢，这么就在两层凝胶交界处使待分离样品区带变窄，浓度升高。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第18页

②在聚丙烯酰胺凝胶中，即使浓缩胶和分离胶用都是Tris-HCl缓冲液。上层浓缩胶pH为6.7下层分离胶pH为8.9HC1是强电解质，不论在哪层胶中，HCl几乎都发生电离，C1-充满整个胶体。待分离样品加在顶部，浸在pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液中。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第19页电泳一开始，有效泳动率最大Cl-快速跑到最前边，成为快离子(前导离子)。在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％甘氨酸有效泳动率最低，跑在最终面，成为慢离子(尾随离子)。这么，快离子和慢离子之间就形成了一个不停移动接口。在pH6.7条件下带有负电荷样品，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于接口附近，逐步形成一个区带。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第20页

图4电泳过程示意图

A为电泳前3层凝胶排列次序，3层胶中都有快离子，慢离子

B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。

提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第21页图5不连续系统浓缩效应示意图

提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第22页在pH6.7凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出氯根(C1-)尾随离子(trailingion)或慢离子：甘氨酸根

mcl

cl>mp

p>mG

GCl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根有效迁移率=m

，m为迁移率，

为解离度因为快离子快速向前移动，在其原来停留那部分地域成了低离子浓度区，及低电导区。电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有以下关系：V=I/S提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第23页在电流恒定条件下，低电导区两侧就产生了较高电位梯度，使样品和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。在这个追赶中被逐步地压缩聚集成一条更为狭窄区带。这就是浓缩效应。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第24页当样品分子和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率快速加大到超出全部样品分子，从而赶上并超出全部样品分子。此时，不连续高电位梯度不再存在。在分离胶电泳过程中，样品在一个均一电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统分离条带清楚度及分辨率大大提升，所以已成为当前广泛使用分离分析伎俩。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第25页蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时．它迁移率取决于它所带净电荷以及分子大小和形状等原因。1967年，Shapiro等人发觉，假如在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，简称SDS)，则蛋白质分子电泳迁移率主要取决于它分子量Mr，而与所带电荷和形状无关。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第26页SDS测定蛋白质分子量Mr原理SDS是一个阴离子表面激活剂，在蛋白质溶液里加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中二硫键还原；SDS能使蛋白质氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质结合百分比为1.4gSDS/1g蛋白质。因为十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质SDS-复合物都带上相同密度负电荷，它量大大超出了蛋白质原有电荷量，因而掩盖了不一样种类蛋白质间原有电荷差异。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第27页SDS与蛋白质结合后，还引发了蛋白质构象改变。蛋白质-SDS复合物流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中形状，近似于雪茄烟形长椭圆棒，不一样蛋白质SDS复合物短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质Mr成正比改变。基于上述原因，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状影响，而只与椭圆棒长度相关，也就是蛋白质Mr函数。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第28页当蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，样品迁移率与其分子量对数呈线性关系。符合以下方程式：LgMW=－b

mR+K

MW：蛋白质分子量，mR：相对迁移率，b：斜率，K：截距。当条件一定时，b与K均为常数

已知分子量蛋白与未知蛋白比较，就能够得出未知蛋白分子量提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第29页LgMW=－b

mR+K提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第30页用SDS测定蛋白质Mr应注意问题：1．假如蛋白质-SDS复合物不能到达1.4SDS／lg蛋白质比率并含有相同构象，就不能得到准确结果。影响蛋白质和SDS结合原因主要有以下3个：(1)二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内二硫键被彻底还原情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之含有相同构象。—般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需深入将形成巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第31页(2)溶液中SDS浓度：溶液中SDS总量，最少要比蛋白质量高3倍，普通需高达10倍以上。(3)溶液离子强度：溶液离子强度应较低，最高不能超出0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团混合体而存在.SDS结合到蛋内质分子上量，仅决定于平衡时SDS单体浓度而不是总浓度.在低离子强度溶液中，SDS单体含有较高平衡浓度。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第32页2．不一样凝胶浓度适合用于不一样Mr范围.Weber试验指出，在5%凝胶中，Mr为25000～200000蛋白质，其Mr对数与迁移率呈直线关系；在10％凝胶中，Mr为10000～70000蛋白质，其Mr对数与迁移率呈直线关系；在15％凝胶中，Mr为10000～50000蛋白质，其Mr对数与迁移率呈直线关系；3.33％(以上各种浓度凝胶，其交联度都是2.6%)凝胶可用于Mr更高蛋白质。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第33页Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第34页可依据所测Mr范围选择最适凝胶浓度，并尽可能选择Mr范围和性质与待测样品相近蛋白质作标准蛋白。标准蛋白质相对迁移率(蛋白质电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率)最好在0.2～0.8之间均匀分布。在凝胶电泳中，影响迁移率原因较多，而在制胶和电泳过程中，极难每次都将各项条件控制得完全一致，所以用SDS凝胶电泳法测定Mr，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳标准曲线。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第35页

3．有许多蛋白质，是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如胰凝乳蛋白酶)组成，它们在SDS和疏基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链。对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定只是它们亚基或单条肽链Mr，而不是完整分子Mr。

为了得到更全方面资料，还必须用其它方法测定其Mr及分子中肽链数目等，与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果相互参考。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第36页4．不是全部蛋白质都能用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其Mr.已发觉电荷异常或构象异常蛋白质，带有较大辅基蛋白质(如一些糖蛋白)以及一些结构蛋白（如胶原蛋白等）用这种方法测定出Mr是不可靠。如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，尽管结合了正常量SDS，仍不能完全掩盖其原有电荷影响。它Mr是21000，但SDS-凝胶电泳测定结果却是35000。所以，要确定某种蛋白质分子量时，最好用两种方法相互验证，则更为可靠。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第37页三．试验材料试验二所得纯化菠萝蛋白酶样品，低分子量标准蛋白样品四．仪器设备夹心式垂直板电泳槽、直流稳压电电泳仪、恒温水浴锅、微量加样器、移样器、电炉等。五．玻璃器皿100mL烧杯，吸管、玻棒，移液管或移液器5mL、1mL、0.5mL，漏斗，滤纸，试剂瓶（1000mL、500mL、250mL等）。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第38页六．试验试剂要求：（1）SDS—PAGE几个试剂配制，严格按照各试剂特点和要求配制。（2）低分子量标准蛋白样品配制。（3）待测纯化蛋白质样品处理。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第39页试验试剂配制

(1)30%凝胶贮液：取30g丙烯酰胺（Acr）、0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis),（先用约50mL蒸馏水溶解，如溶解不了,可加热30℃～50℃溶解,再用量筒定容至100mL，然后过滤，后置于棕色瓶。4℃下保留备用）。(2)10%过硫酸铵(AP)溶液：取2g过硫酸铵溶解后，定容至20mL，现配现用。(3)1mol/LHCl500mL：取浓HCl42mL，加蒸馏水至500mL(在通风橱中操作)。(4)分离胶缓冲溶液（1.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8）:取18.15gTris溶解后，加1mol/LHCl溶液约48mL，调pH至8.8,定容至100mL(Tris为三羟甲基氨基甲烷或缓血酸铵)。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第40页(5)浓缩胶缓冲液(0.5mol/LTris-HCl缓冲液,pH6.8):取6gTris溶解后，加1mol/LHCl溶液40mL，调pH至6.8，定容至100mL(Tris为三羟甲基氨基甲烷或缓血酸铵)。(6)10%SDS(十二烷基硫酸钠)溶液:取5gSDS加水定容至50mL。（加热溶解）(7)电极缓冲液(0.1%SDS–0.05mol/LTris–0.384mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3):取6gTris，28.8g甘氨酸(氨基乙酸)和1gSDS加水溶解后，调pＨ值至8.3，定容至１000mＬ（配好试剂其pＨ为8.3）(12个组可配浓缩2倍母液5升,使用时再稀释.)。

提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第41页(8)样品溶解液：取SDS２g，β-巯基乙醇５mL，甘油10mL，溴酚蓝0.1g，0.5mol/L，Tris–HCl缓冲液,pＨ6.8(即上述浓缩胶缓冲液)10mL，加蒸馏水25mL，(最终总体积为50mL),装于棕色瓶。(9)染色液（0.1%考马斯亮蓝-45%甲醇-10%冰乙酸溶液）：1g考马斯亮蓝R250，加入450mL甲醇、100mL冰乙酸，用水定容至1000mL。(12个组可配mL)(10)脱色液（0.25mol/LNaCl）：取14.6gNaCl，加水定容至1000mL(12个组可配3000mL)。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第42页七．试验步骤1、清洗并吹干玻璃板。2、在塑料胶条两面涂少许凡士林（注意不能涂多，以防弄脏玻璃板）。3、安装好电泳槽（玻璃板）。4、封胶：用小烧杯加6mL蒸馏水，2mL30%凝胶储液，200uL10％TEMED（原液），200uL10％过硫酸铵（AP），混匀，用滴管滴加于封口槽处，静置约10min直到凝固。5、加dH2O于两层玻璃之间，检验玻璃底是否漏水；假如漏水，要重装。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第43页图2夹心垂直板电泳槽示意图

图3凝胶模示意图

1.样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框

4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统

返回提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第44页12%分离胶5%浓缩胶

30%凝胶贮液4000μl810μl上层胶缓冲液pH6.8—2500μl下层胶缓冲液pH8.85000μl—TEMED（四甲基乙二胺)10μl7μl10%SDS100μl50μldH2O0.65μl1500μlAP（过硫酸氨）0.15μl70μl提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第45页6、用小烧杯按下表1配下层胶（分离胶），胶浓度为12%，混匀，灌胶，高度离梳子约1～1.5cm，然后覆盖一层水，凝胶时间为15～30min，胶与水分层，倾倒去水。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第46页

*水封胶作用：保持分离胶上沿平直，排气泡

*胶凝好标志：胶与水层之间形成清楚界面

7、用小烧杯按上表1配上层胶（浓缩胶），胶浓度为５％，混匀，灌胶，插入梳子。

*梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第47页8、在凝胶过程中，液面下降，要补充胶液，凝胶时间约10～20min，凝好胶，拔掉梳子。9、加入稀释电极缓冲液，浸泡至上槽（低玻璃面），但不能超出下槽（高玻璃面），注意不能漏水。*用吸管将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置气泡全部排出10、加热样品（沸水浴数处理3min）。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第48页11、微量注射器按下表2点样，隔孔点样，注意不要交叉污染（每点一个样都要清洗微量注射器）。表2点样方式孔1234567891011加样粗酶标准蛋白过柱1过柱2过柱3体积μL30～4030353535*微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第49页12、上槽接负极（－），下槽接正极（＋）。13、恒电压电泳：浓缩胶，80V，约1h；分离胶，160V，约3h。14、取胶，做好记号（左→右）。15、染色（新配染色液只需染50℃20～30min），回收染色液。16、脱色：加脱色液50℃2～3h处理，或常温脱色数天,即可看到条带。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第50页提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第51页17、拍照并画电泳图谱，计算标准蛋白、待测样品相对迁移率蛋白相对迁移率＝蛋白迁移距离/指示剂迁移距离18、用低分子量标准蛋白质所作标准曲线，求待测样品亚基相对分子量。以标准蛋白质电泳相对迁移率为横坐标(X)，标准蛋白质分子量对数为纵坐标(Y)，绘标准蛋白质标准曲线，再依据样品相对迁移率在曲线上求出其蛋白质分子量。提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第52页蛋白名称迁移距离相对迁移率（Y）蛋白分子量(D)蛋白分子量对数(X)兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200牛碳酸酐酶43000牛蛋白酶抑制剂31000鸡蛋清溶菌酶0过柱菠萝蛋白酶14400指示剂------提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定第53页低分子量标准蛋白质组分：1)兔磷酸化酶B分子量97,400(道尔顿)2)牛血清白蛋白分子量