分光光度技术和蛋白含量测定

分光光度技术和蛋白含量测定分光光度技术和蛋白含量测定第1页理论

掌握分光光度技术基础原理了解分光光度计基础结构试验

利用分光光度计进行蛋白质定量测定

1.双缩脲法测定蛋白质含量

2.考马斯亮兰结正当测定蛋白质含量

3.紫外分光光度法测定蛋白质含量

此次试验内容分光光度技术和蛋白含量测定第2页分光光度技术（Spectrophotography）分光光度技术和蛋白含量测定第3页

一、基础定义

利用物质特有吸收光谱来判别物质或测定其含量一项技术。

应用：定性、定量

优点：灵敏度高准确度高操作简便、快速

分光光度技术和蛋白含量测定第4页二、工作原理

1.物质对光线有选择性吸收作用。

2.每种物质都含有其特征性吸收光谱。

3.在一定条件下，物质对光吸收程度与该物质浓度成正比。

分光光度法所使用光谱范围：

200nm--10μm200-400nm400-760nm760-10000nm紫外光区可见光区红外光区分光光度技术和蛋白含量测定第5页

怎样定性？

—

利用吸收光谱判定化合物利用分光光度计绘制吸收光谱曲线

用各种不一样单色光分别经过某一溶液，测定此溶液对每一个单色光吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，即吸收光谱曲线。每种物质有其特征性吸收光谱分光光度技术和蛋白含量测定第6页

1.朗伯（Lambert）定律

一束单色光经过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质厚度增加呈指数降低。

I/I0=e-K1lI0:入射光强度；I

:透射光强度；l：介质厚度

怎样定量？

—

Lambert-Beer定律分光光度技术和蛋白含量测定第7页2．比尔（Beer）定律一束单色光经过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质浓度增加呈指数降低。

I/I0=e-K2CI0:入射光强度；I

:透射光强度；C：介质浓度

分光光度技术和蛋白含量测定第8页3.Lambert-beer’slaw合并一束单色光经过某溶液时，光波被溶液吸收一个别，吸收多少与溶液中溶质浓度和溶液厚度成正比。

I/I0=e-εclA=-lgI/I0=εcl

A：吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度

ε：即摩尔消光系数，也叫摩尔吸光度，溶液浓度为

mol/L,光程为1cm时消光系数分光光度技术和蛋白含量测定第9页4.计算（1）标准管法（标准比较法）

实际测定过程中，用一已知浓度测定物按测定管一样处理显色，读出吸光度，再依据前式计算。

A标准=ε标准C标准L标准

A样品=ε样品C样品L样品

A：吸光度；ε

：摩尔吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度分光光度技术和蛋白含量测定第10页

因标准液和样品液中溶质为同一物质，

ε样品=ε标准因盛标准液和测定液比色杯径长相同

L样品=L标准故上二式可写成：

A标准/A样品=ε标准C标准/ε样品C样品

C样品=A样品/A标准×C标准分光光度技术和蛋白含量测定第11页（2）标准曲线法

配制一系列已知不一样浓度测定物溶液，按测定管一样方法处理显色，分别读取各管吸光度。以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线，依据测得吸光度值从标准曲线上读得测定物浓度。

分光光度技术和蛋白含量测定第12页标准曲线使用注意事项①标准曲线范围在测定浓度二分之一到二倍之间。②吸光度在0.05-1.0范围内。③所作标准曲线仅供短期使用。④标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，防止误差产生。分光光度技术和蛋白含量测定第13页5．应用中注意问题①Lambert-beer’slaw偏离：该定律只适应于一定浓度范围，稀溶液能很好服从该定律，A宜在0.05～1.0之间，超出该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符②选择波长：最大吸收波长，因为a.灵敏；b.防止杂质干扰③参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶质以外全部成份。分光光度技术和蛋白含量测定第14页

空白管：

测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定光吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它成份完全相同。测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色皿本身对光吸收，又消除了非待测物对光吸收，所测值即为待测物造成光吸收。分光光度技术和蛋白含量测定第15页分光光度计分光光度技术和蛋白含量测定第16页一．基础部件

1．光源分光光度计上常见光源有两种，即钨灯和氢灯

(或氘灯)。在可见光区，近紫外光区和近红外光区常见钨灯；在紫外光区，多使用氢灯。

2．单色器棱镜或光栅，把混合光分解为单一波长光。

3．吸收池（比色皿、比色池）选取适当比色皿（可见光—玻璃；紫外光–

石英；规格、新旧程度一致）

4．检测器

5．测量装置

分光光度技术和蛋白含量测定第17页

二.分光光度计使用步骤（示教）三.使用时注意事项

1.波长选择。

2.机器预热。

3.不测量时，应使样品室盖处于开启状态，不然会使光电管疲劳。

4.不应把成有腐蚀性液体比色皿放在仪器表面。

5.比色皿使用注意事项分光光度技术和蛋白含量测定第18页1.因为紫外光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测量时要用石英比色皿。

2.同组使用比色皿必须配套（规格、新旧程度一致）。

3.比色皿2光面与2毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，不然会引发光吸收增加。

4.比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，普通所盛液体约占全部容积2/3。

5.腐蚀性溶液不得长久盛放在比色皿中。

6.每次使用后,应马上倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色皿3～4次。此次试验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。分光光度技术和蛋白含量测定第19页蛋白质定量分析试验

试验一双缩脲法测定蛋白质含量

试验三考马斯亮兰结正当测定蛋白质含量

试验四紫外分光光度法测定蛋白质含量

分光光度技术和蛋白含量测定第20页

试验一双缩脲法测定蛋白质含量【基础原理】

蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色化合物（称双缩脲反应）。在一定浓度范围，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质含量。含有两个以上肽键物质才有此反应，故氨基酸无此反应。双缩脲法灵敏度为1-20mg。分光光度技术和蛋白含量测定第21页试剂（ml）123456标准蛋白质溶液0.10.30.50.70.9—生理盐水0.90.70.50.30.11.0双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.0【操作步骤】（一）标准曲线绘制1.取小试管6支，编号按下表操作2．混合后，于37℃水浴中放置15分钟，在520nm波长下比色，以

第6管调零，测得各管吸光度值。以各管吸光度值为纵座标，蛋白质浓度克数为横座标，绘成曲线。分光光度技术和蛋白含量测定第22页（二）样品测定：

取血清样品0.1ml，加生理盐水0.9m1，再加双缩脲试剂4m1，于37℃水浴中放置15分钟，测其吸光度，依据吸光度值查标准曲线并计算得出每l00ml血清（样品）中蛋白质克数。

注意：双缩脲法灵敏度为1-20mg，取蛋白标准液时注意浓度试验时，样品管可与标准管同时处理分光光度技术和蛋白含量测定第23页【基础原理】

考马斯亮兰G-250存在着两种不一样颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质可经过范德华力结合，与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm变成595nm，能过测定595nm处光吸收增加量可知与其结合蛋白质量。

优点：灵敏度高，1-5μg；测定速度快；干扰物质少。现已被广泛使用。试验三考马斯亮兰结正当测定蛋白质含量分光光度技术和蛋白含量测定第24页1．取试管3支，编号按下表操作

试剂（ml）空白标准标本生理盐水0.1

蛋白标准液(50ug／ml)0.1

样品0.1

考马斯亮蓝试剂5.05.05.02.混匀，放置5分钟，在波长595nm处，以空白管调“0”，测定各管吸光度。【操作步骤】分光光度技术和蛋白含量测定第25页3.计算

A标本/A标准

×50（µg/ml）

=样品中蛋白质含量（µg/ml）

注意：蛋白标准液浓度50µg/ml分光光度技术和蛋白含量测定第26页试验四紫外分光光度法测定蛋白质含量【基础原理】

因为蛋白质分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白质含有吸收紫外光性质，吸收高峰在280nm波长处。因为各种蛋白质所含芳香族氨基酸量相差极少，所以在此波长范围内，吸收峰光密度值与其浓度成正比关系，可作定量测定。灵敏度：50-100μg分光光度技术和蛋白含量测定第27页【操作步骤】（一）制作标准曲线

1.取试管6支，编号，按下表操作。试剂（ml）12345