十二核酸的生物合成专家讲座

第十二章核酸生物合成十二核酸的生物合成专家讲座第1页

主要内容一

DNA生物合成二

RNA生物合成十二核酸的生物合成专家讲座第2页中心法则

（centraldogma）

复制：是亲代双链DNA按碱基配对标准，准确形成两个相同核苷酸序列子代DNA分子过程。两条DNA链都可作为复制模板。

转录：是以一条DNA链为模板，将DNA链上储存遗传信息按碱基配对标准准确转换成互补mRNA过程。

翻译：是以mRNA为模板，将mRNA上遗传信息转换成蛋白质氨基酸序列过程。

中心法则：遗传信息由DNAmRNAPro流动路径。

十二核酸的生物合成专家讲座第3页蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA中心法则：遗传信息由DNAmRNAPro流动路径。补充和完善之处：A：RNA作为遗传物质能自我复制，并作为mRNA指导Pro合成。B：RNA能以逆转录方式将遗传信息传递给DNA分子。十二核酸的生物合成专家讲座第4页十二核酸的生物合成专家讲座第5页十二核酸的生物合成专家讲座第6页

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶催化下按碱基互补标准合成两条与模板链互补新链，以组成新DNA分子。这么新形成两个DNA分子与亲代DNA分子碱基次序完全一样。因为子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成，这种复制方式称为半保留复制。一、

DNA生物合成

（一）半保留复制

十二核酸的生物合成专家讲座第7页

[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNA1958年Meselson&stahl用同位素示踪标识加密度梯度离心技术试验,证实了DNA是采取半保留方式进行复制.DNA半保留复制试验依据十二核酸的生物合成专家讲座第8页

Meselson-stahl试验（a）密度梯度离心DNA带（b）对应于左侧DNA带解释十二核酸的生物合成专家讲座第9页（二）DNA复制起点和方向

复制叉（replicationforks）

：复制中DNA分子，未复制部分是亲代双螺旋，而复制好部分是分开，由两个子代双螺旋组成，复制正在进行部分叫做复制叉。细胞内存在着能识别起始点特种Pr。

十二核酸的生物合成专家讲座第10页

方向：复制叉从起始点出发，沿DNA移动，移动方向与前导链延长方向相同。复制可能是单向，也可能是双向，两个方向复制速度不一定相同。大多数是双向。

眼状结构：线状DNA分子上正在复制部分形成；

θ结构：环状DNA分子上正在复制部分形成。

十二核酸的生物合成专家讲座第11页DNA双向和单向复制环状

DNA复制时所形成Q结构起始点复制叉推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制十二核酸的生物合成专家讲座第12页两种复制模式（a）单向复制模式（b）大肠杆菌染色体DNA双向复制模式十二核酸的生物合成专家讲座第13页单向复制i双向复制观察到放射自显影图象十二核酸的生物合成专家讲座第14页18%质粒ColE1单向复制示意图单向复制十二核酸的生物合成专家讲座第15页最早研究DNA复制起点和方向是J.Cairns（1963年）。θ型十二核酸的生物合成专家讲座第16页DNAReplication十二核酸的生物合成专家讲座第17页原核生物：只有一个复制原点。第二次复制可在第一次复制完成之前开始复制。真核生物；可在DNA链上多个不一样位点同时起始复制。

所以真核生物DNA复制速度比原核生物快些。

十二核酸的生物合成专家讲座第18页真核生物DNA多起点复制十二核酸的生物合成专家讲座第19页（三）DNA复制过程（原核生物）

DNA合成是以四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dGTP、dCTP、dTTP为前体，在DNA聚合酶催化下，向DNA3′—OH端添加脱氧核苷酸，在DNA3′—OH与添加脱氧核苷酸5′—磷酰基间形成3，5—磷酸二酯键，反应中脱去一个焦磷酸基团。

合成方向：5′3′

十二核酸的生物合成专家讲座第20页添加到链上每个核苷三磷酸是按照模板链次序由碱基互补配对标准选择。

反应通式可写为：（NMP）n—3′—OH＋dNTP

（NMP）n＋1—3′—OH＋PPi

十二核酸的生物合成专家讲座第21页1、DNA聚合酶ⅠpolⅠ

(1)具5′3′聚合酶活性将脱氧核糖核苷三磷酸dNTP逐一添加到含有3′—OH末端多核苷酸链上形成3，5—磷酸二酯键。

特点：A：底物为dNTP；B：DNA模板(3′5′)；C：引物：RNA引物（带3′—羟基）；D：方向5′3′；F：产物DNA性质与模板相同。十二核酸的生物合成专家讲座第22页DNA聚合酶催化链延长反应5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´3´5´模板链十二核酸的生物合成专家讲座第23页

(2)含有3′5′端核酸外切酶活性

有校对功效，能在3′—OH端将DNA链水解。以确保DNA复制真实性。

十二核酸的生物合成专家讲座第24页DNA聚合酶3´-5´外切酶水解位点3´3´5´5´错配碱基3´-5´核酸外切酶水解位点十二核酸的生物合成专家讲座第25页(3)含有5′3′端核酸外切酶活性由5′端水解DNA链，主要是切去一小段DNA，包含RNA引物和损伤DNA部分。

polⅠ主要功效：用于修复DNA双螺旋区中单链区，这些单链区是在DNA复制时或DNA受损伤后留下。活性高。

十二核酸的生物合成专家讲座第26页DNA聚合酶5´-3´外切酶活力

5´-3´核酸外切酶水解位点单链缺口5´十二核酸的生物合成专家讲座第27页2、DNA聚合酶ⅡpolⅡ

含有3′5′端核酸外切酶活性，主要负责DNA修复，在一定程度上参加DNA复制。活性低。功效不十分清楚，是一个修复酶。

十二核酸的生物合成专家讲座第28页3、DNA聚合酶ⅢpolⅢ是使DNA链延长主要聚合酶，当前已知全酶是由7种多肽形成复合物，含有10种共22个亚基组分（α2ε2θ2ζ2г2δ2δ2′2χ2ψ2β2）和Zn原子。十二核酸的生物合成专家讲座第29页大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶结构和功效

延长因子DNA聚合酶Ⅲ两个亚基夹住DNADNA聚合酶Ⅲ异二聚体关键酶校对引物结合和识别促使关键酶二聚化十二核酸的生物合成专家讲座第30页（1）α亚基：具5′

3′端聚合酶活性（需模板和引物）；（2）ε亚基具3′

5′端核酸外切酶活性。校对作用，以提升保真性；（3）α、ε、θ亚基相连形成关键酶polⅢ，θ亚基起组建作用；（4）关键酶+ζ亚基后成为二聚体，称为polⅢ′；（5）polⅢ′与γ、δ亚基结合，形成polⅢ′，γ、δ亚基可增强酶与模板结合；（6）polⅢ′′与β亚基结合形成全酶，β亚基如同夹子，夹住DNA向前滑动，不脱离，提升连续合成能力。

十二核酸的生物合成专家讲座第31页大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比较项目DNA聚合酶III切除引物修复修复复制功效

1999年发觉聚合酶

和

，它们包括DNA错误倾向修复（erroounerepair）十二核酸的生物合成专家讲座第32页polⅠ不是DNA复制酶，理由：A、该酶合成DNA速度太慢，只是细胞内DNA复制速度1%；B、连续合成能力较低，而细胞内DNA复制不会频繁中止；C、许多基因突变都会影响DNA复制，但都与polⅠ无关。

十二核酸的生物合成专家讲座第33页

3、双链DNA复制分子机制（1）冈崎片段和半不连续复制不连续复制：3’→5’走向DNA实际上是由许多5’→3’方向合成DNA片段连接起来。（已知DNA聚合酶合成方向都是5’→3’）十二核酸的生物合成专家讲座第34页在一个复制叉内两条链复制方向、合成方式、复制速度是不一样。

前导链（leadingstrand)：以一条链（3’→

5’）为模板时，子代链合成方向是5’→3’，合成是连续，合成速度较快。

十二核酸的生物合成专家讲座第35页后随链(laggingstrand):以另一条亲代链（5’→

3’）为模板时，子代链合成方向不能按照3’→5’方向进行，因为迄今没有发觉这么DNA聚合酶，所以只能合成方向为5’→

3’方向许多DNA小片段（约1000--------dp，7-----10S），为1968年日本人冈崎等人发觉，叫冈崎片段，然后在DNA连接酶催化下，连接起来形成一条子代链。合成是不连续，合成速度较慢。当一段新冈崎片段合成后，polⅠ行使5’→3’核酸外切酶活性切除引物，再合成一段DNA作为替换，缺口由DAN连接酶封口。

十二核酸的生物合成专家讲座第36页(2)冈崎片段RNA引物引物合成由引物合成酶催化完成，这些酶在模板单链DNA上识别特殊序列，合成RNA引物。它本身没有活性，需要与“引发前体”结合在一起，形成“引发体”后才有活性。引发体在复制叉上移动，识别合成起始点，引发RNA引物合成，该过程需ATP提供能量。十二核酸的生物合成专家讲座第37页方向：以DNA为模板，5’→3’长度：几个至10个核苷酸，5′端含3个磷酸残基，3′端为游离羟基。DNA聚合酶III

：聚合脱氧核糖核苷酸引物消除和缺口填补：DNA聚合酶IDNA连接酶：将冈崎片段连成长链十二核酸的生物合成专家讲座第38页为何需要RNA引物、而且最终要切除？1、DNA聚合酶有校正功效，每引入一个核苷酸都要复查一次，无误后方继续下去，它不能从无到有合成新链，因为在未核实前一个核苷酸处于正确配对状态时是不会进行聚合反应；2、RNA引物是从新开始合成，错配可能性大，在完成引物功效后即将它删除，而代之以高保真DNA链。

十二核酸的生物合成专家讲座第39页解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物十二核酸的生物合成专家讲座第40页十二核酸的生物合成专家讲座第41页（3）DNA连接酶催化子代双链DNA中切口处相邻3’-OH和5’-磷酰基之间形成磷酸二酯键。但不能将两条游离DNA单链连接起来。同时该酶要求含有3’-OH和5’-磷酰基DNA片段能以氢键与互补链结合。

DNA—3′—OH＋P—5′—DNA＋ATP（NAD+）

DNA—3′—O—P—5′—DNA＋AMP＋PPi（NMN）

十二核酸的生物合成专家讲座第42页

E,coli连接酶催化下连接机制十二核酸的生物合成专家讲座第43页连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链十二核酸的生物合成专家讲座第44页（4）母本DNA双链分离解螺旋酶（helicase）使DNA双螺旋两条链分开。条件：ATP提供能量，有单链DNA存在。后随链：解旋酶结合于它模板上，移动方向是5′3′前导链：另一个解旋酶叫rep蛋白，移动方向是3′5′。

十二核酸的生物合成专家讲座第45页单链结合蛋白（single-strandbindingprotein，SSB）结合在单链DNA分子上，功效是稳定已被解开DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。

十二核酸的生物合成专家讲座第46页拓扑异构酶（DNA松弛酶）（topoisomerase）包括超螺旋松弛，复制后又包括到它们再次形成。

正超螺旋（左）：双螺旋DNA处于拧紧状态时形成超螺旋，使DNA解开双螺旋困难负超螺旋（右）：双螺旋DNA处于拧松状态时形成超螺旋。十二核酸的生物合成专家讲座第47页拓扑异构酶对DNA超螺旋进行准确调整，从而在DNA重组修复和DNA其它转变中起作用。分为两类：1、拓扑异构酶Ⅰ：可瞬时打开双螺旋一条链，然后再连接。不需能量，同转录相关。2、拓扑异构酶Ⅱ；使DNA双链同时断裂，然后再连接。需能量ATP，同复制相关。

拓扑异构酶Ⅰ可除去负超螺旋，拓扑异构酶Ⅱ可引入负超螺旋，消除复制前产生正超螺旋，协同作用控制DNA拓扑结构，有利于DNA解开双螺旋。十二核酸的生物合成专家讲座第48页参加大肠杆菌染色体DNA复制主要PrDNA旋转酶→引入（或松解）DNA解链酶→使双螺旋DNA解链单链结合蛋白→稳定单链区引物合成酶→合成RNA引物DNA聚合酶III全酶→合成DNADNA聚合酶I→除去引物并填满缺口DNA连接酶→连接DNA片段末端十二核酸的生物合成专家讲座第49页（5）DNA聚合酶“校对”作用DNA聚合酶含有三种不一样酶活性。3’→5’外切酶活性是校对新生DNA链和更正聚合酶活性所造成“错配”一个伎俩。现在所发觉真核生物DNA聚合酶普通没有校正功效。十二核酸的生物合成专家讲座第50页DNA聚合酶校对功效聚合酶错配碱基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸十二核酸的生物合成专家讲座第51页（四）真核细胞DNA复制不十分清楚，与原核生物DNA复制比较：

（一）一致：1、基本机制相同。如半保留复制、半不连续复制。2、所需酶相同。十二核酸的生物合成专家讲座第52页（二）区分

真核生物

原核生物复制起始点

多个

一个复制方向

双向

单向复制速度

较快

较慢起始点是否连续复制

不

是催化DNA链延长酶

两种酶（polα、δ）

一个酶（polⅢ）引物酶结合情况

与DNA聚合酶

与解旋酶十二核酸的生物合成专家讲座第53页DNA聚合酶αβγδε定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核亚基数目412最少2>1外切酶活性无无3’→5’3’→5’3’→5’引物合成酶活性有无无无无功效复制过程中合成后随链参加核DNA修复线粒体DNA复制催化前导链合成参加DNA修复十二核酸的生物合成专家讲座第54页端粒复制（1）半保留复制（2）可朝一个方向或两个方向进行复制（3）DNA两条链都从5’→3’（4）复制是半不连续，前导链连续，后随链不连续合成（5）合成始于一小段RNA引物（6）复制有各种机制十二核酸的生物合成专家讲座第55页（五）反转录作用（RNA指导DNA合成）指以RNA为模板合成DNA过程。

最先在病毒中发觉这种酶，现在发觉存在于哺乳动物胚胎和正在分裂细胞中。

十二核酸的生物合成专家讲座第56页条件1、反转录酶：是一个多功效酶，具以下特征：（1）以RNA为模板合成DNA；（2）水解RNA，具3’→5’和5’→3’外切酶活性；（3）以DNA为模板合成DNA。2、前体物质：dNTP3、引物：短链RNA或DNA

适当浓度Mg2＋、Mn2＋4、方向：5’→3’十二核酸的生物合成专家讲座第57页过程1、以亲代RNA为模板合成一条与RNA互补DNA链（cDNA），形成RNA—DNA杂交分子。2、由核糖核酸酶H水解RNA—DNA杂交分子中RNA链；3、以刚合成DNA链为模板合成一条互补DNA链，形成DNA—DNA分子；4、DNA—DNA去向（1）整合到宿主细胞DNA分子中，但不表示；（2）DNA—DNA再转录合成RNA，然后翻译成蛋白质，生成子代RNA病毒。十二核酸的生物合成专家讲座第58页反转录过程中cDNA合成

依赖RNADNA聚合酶核糖核酸酶H活力依赖DNADNA聚合酶十二核酸的生物合成专家讲座第59页十二核酸的生物合成专家讲座第60页突变基因组DNA碱基次序发生突然而永久性改变。

1、点突变：指一个或几个碱基对被置换。有两种形式：转换：一个嘌呤碱基或一个嘧啶碱基转换为另一个嘌呤或嘧啶碱基。如TA被CG替换。颠换：嘌呤碱基变成嘧啶碱基或嘧啶碱基变成嘌呤碱基。如TA被AT替换。2、结构畸变DNA大段碱基发生改变。包含：插入、缺失、倒位、易位。

（六）DNA损伤与修复十二核酸的生物合成专家讲座第61页

DNA突变类型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-转换野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换碱基正确置换(substitution)移码突变(framesshiftmutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT十二核酸的生物合成专家讲座第62页造成DNA损伤原因可能是生物原因、物理原因或是化学原因；可能来自细胞内部，也可能来自细胞外部；受到破坏可能是DNA碱基、糖基或是磷酸二酯键。物理诱变剂：如紫外线、X射线等。生物诱变剂：如噬菌体、抗菌素等。化学诱变剂：直接作用于DNA模板诱变剂，