江苏省杂草稻rc基因序列测定及分析

江苏省杂草稻rc基因序列测定及分析

水稻通常是世界上广泛分布的。亚洲、非洲、南美洲和大西洋等50多个国家都有关于杂草水稻的报告。杂草稻具有较强的生物竞争性,与栽培稻竞争光、水分和营养杂草稻的红色果皮是区别于普通栽培稻的一个重要特征Rc基因是水稻果皮原花色素积累途径中最重要的调节基因之一,位于第7染色体上,全长约6.4kb,包含有8个外显子,产物为一个具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)元件的调节蛋白为了说明江苏省杂草稻红色果皮基因的变异类型及探讨其来源,在对江苏省杂草稻进行全面调查的基础上1材料和方法1.1江苏省杂草稻1份序列分析样品总计179份,其中我们新测定了13份样品,其余166份样品来源于NCBI和现有文献。新测定的样品包括来自南通如皋(WRL-1047)、江都(WRL-1334)、常州(WRL-2537)、连云港赣榆(WRL-3446)、徐州邳州(WRL-3478)、盐城建湖(WRL-3710)、淮安(WRL-3738)、泰州兴化(WRL-3779)、南京江宁(WRL-4658)和苏州(WRL-4781)的杂草稻各1份,以及江苏粳型栽培稻(WRL-163)1份,连云港穞稻(WRL-162)1份,安徽塘稻(WRL-1430)1份。其中,江苏连云港穞稻和安徽塘稻至少自生了上百年,自古被认为是杂草稻样品包括66份杂草稻(O.spontanea)[(56份美国南部杂草稻(25°50′N-40°35′N),10份中国江苏杂草稻(30°45′N-35°32′N),1份江苏省连云港穞稻(Ludao),1份安徽省塘稻(Tangdao),1份PerlaRosso,70份栽培稻(O.sativaL.)(来自美国、中国、日本、印度、孟加拉国等)以及24份普通野生稻(O.rufipogonGriff.)与3份一年生野生稻(O.nivaraSharmaetShastay);另外,还包括2份展颖野生稻(O.glumaepatulaSteud.),2份南方野生稻(O.meridionalisNg.),7份非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud.)和2份巴蒂野生稻(O.barthiiA.Chev.)(序列信息见在线辅助性表S2,/CN/article/showSupportInfo.do?id=2442)。1.2独立设计、pcr扩增和序列测量单株种植于南京农业大学江浦农场,于分蘖期收取单株叶片,以SDS法提取DNA1.3处理数据测序片段的拼接和序列比对采用VectorNTI8.02结果与分析2.1日本雪rc基因第735.所有材料利用脱壳机脱去种子外壳,查看颖果果皮颜色(图1-A),其中普通野生稻、穞稻(WRL-162)和塘稻(WRL-1430)以及10份江苏省杂草稻是红色果皮;日本晴与江苏粳型栽培稻(WRL-163)为白色果皮。这排除了江苏省杂草稻以及穞稻(WRL-162)和塘稻(WRL-1430)为rc、Rc-s、rc-g1等位基因型的可能性。采用Primer5.0软件针对日本晴Rc基因第7外显子缺失14bp的部位,设计了PCR引物RED4,其中,RED4-For:5′-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3′,RED4-Rev:5′-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3′。红色果皮RED4PCR理论产物为118bp,白色果皮RED4PCR理论产物为104bp。RED4对稻种样品单株DNA扩增片段PAGE胶电泳结果显示(图1-B),穞稻(WRL-162)和塘稻(WRL-1430)及10份江苏杂草稻、普通野生稻的PCR产物带型一致,片段大小与预期的118bp一致。而日本晴对照材料以及江苏水稻材料均缺失14bp,大小与预期的104bp一致,说明江苏穞稻和杂草稻的红色果皮基因均不存在14bp的缺失,排除了rc为了检测是否还存在其他等位基因,对穞稻、塘稻、10个江苏杂草稻样品、江苏省粳型栽培稻进行Rc全基因测序,并与目前发现的6种Rc等位基因进行共线性分析,结果显示本次测定的江苏10杂草稻样本与穞稻和塘稻均为Rc野生型(图2)。2.2rc基因及进程在179份样品中,去除展颖野生稻(O.gluma-epatulaSteud.)2份、南方野生稻(O.meridionalisNg.)2份、非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud.)7份、巴蒂野生稻(O.barthiiA.Chev.)2份、穞稻和塘稻各1份。将164份样品分为野生稻(n=27)、栽培稻(n=71)、杂草稻(n=66);栽培稻中的粳稻(n=43)和籼稻(n=28);杂草稻中美国杂草稻(n=56)和中国江苏省杂草稻(n=10),进行了Rc基因(6.4kb)核苷酸多样性分析(表1)。结果显示,普通野生稻Rc基因的核苷酸多样性均高于栽培稻和杂草稻,而栽培稻Rc基因的核苷酸多样性高于杂草稻,其中籼稻Rc基因的核苷酸多样性高于杂草稻,粳稻则低于杂草稻。江苏杂草稻Rc基因的单倍型数目(h=3)与美国杂草稻(h=3)相同,但分离位点数(S=5)大于美国杂草稻(S=2);每千个碱基中核苷酸多样性(π=0.19)高于美国杂草稻(π=0.09);同时分离位点比例(θ从Tajima’sD值来看,仅野生稻和栽培粳稻达到了统计学显著水平,其中栽培粳稻的数据极偏离零(P<0.001);而江苏和美国杂草稻的Tajima’sD值(-1.38818和1.41313)均未达到显著水平,符合中性进化定律。同时进一步分析了上述164份样品共同计算结果的高频率单倍型(n≥2)序列差异(图3)。发现普通野生稻高频单倍型最多,仅27个样品就具有5种高频率单倍型;栽培稻其次,71个样品共分离出3种高频率单倍型,并且H1高频率单倍型占有了75.7%的栽培稻样品;而杂草稻高频率单倍型最少,66个样品只分离出2种高频率单倍型,其中H14高频率单倍型为杂草稻所特有。2.3水稻各品种c、n、p-qp基因的进化树及基因组织特点在179份样品中,除去2份展颖野生稻(O.glumaepatulaSteud.)和2份南方野生稻(O.me-ridionalisNg.),保留175份样品,应用Network软件基于最大简约法(maximumparsimonymethod,MP法)来构建Rc基因的网络结构图,以进一步说明江苏省杂草稻Rc基因的来源(图4)。A类群中主要包括普通野生稻和杂草稻,B类群中主要包括栽培稻、穞稻(WRL-162)和塘稻(WRL-1430)。其中白色果皮栽培稻(携带rc型驯化基因样品)共8种单倍型,以H7(n=59)为主要单倍型[(该单倍型中还包括了4个普通野生稻、1个红色果皮栽培粳稻、1个PerlaRosso(Rc进一步采用全部179份稻种样品,以贝叶斯法和最大似然法两种计算方法,分别构建6.4kbRc全长基因的系统进化树。两种方法得到的进化树基本一致,不同点仅在于2份展颖野生稻(O.gluma-epatulaSteud.)、7份非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud.)和2份巴蒂野生稻(O.barthiiA.Chev.)间排列位置的微小差异(图5)。图中rc驯化等位基因与红色果皮粳稻地方品种聚为一类,这其中包括穞稻(WRL-162)和塘稻(WRL-1430);Rc-s驯化等位基因则与红色果皮的Aus种及籼稻地方品种更为接近;而江苏省杂草稻与美国杂草稻聚为一类,与之邻近的是普通野生稻、AUS种、香稻以及红色果皮栽培稻。3讨论3.1杂草稻红稻类型红色果皮是杂草稻(weedyrice)的重要鉴别特征之一,所以杂草稻又被称为红稻(redrice)。同时,也是其产生危害的重要因素,如导致栽培稻品质及价格显著降低3.2江苏省杂草稻rc基因的核苷酸多样性和单倍型分析以往的研究表明,同一区域的杂草稻遗传多样性低本研究同时分析了164份样品的高频率单倍型(图4),虽然杂草稻与栽培稻具有很高的遗传相似性此外,江苏10份杂草稻Rc基因的核苷酸多态性(π=0.19)和分离位点比率(θ3.3基因的贝叶斯进化树与江苏省杂草稻的聚类分析关于江苏省杂草稻的红色果皮基因来源,目前的研究主要有三种假设进一步构建了179份样品Rc基因的贝叶斯进化树与最大似然(ML)树(图5)。结果两种计算方法得出的聚类图表明,在系统树中与江苏省杂草稻临近的是普通野生稻、AUS种、香稻以及红色果皮栽培稻。这与Rc基因单倍型进化网络的分析结果相似(图4),同时,也与美国杂草稻的研究结果类似。Gross等3.4江苏正发生的杂草稻与稻、塘稻的rc基因亲缘关系江苏省杂草稻危害的报道较早出现于21世纪初本研究通过构建来自全球175份稻种Rc6.4kb全长基因的单倍型进化网络(图4),证明穞稻和塘稻虽与江苏