具有黄自溶活性的腺嘌吟营养缺陷型菌株的选育

具有黄自溶活性的腺嘌吟营养缺陷型菌株的选育

目前，国外正在开发出一种新的祖母食品营养基金。食用营养酵母主要是在可食用酵母(如酿酒酵母、产朊假丝酵母、乳酸酵母)所含有的天然营养成分基础上(其细胞内蛋白质、维生素及多种通过人体可同化的生物成分含量非常丰富,其氨基酸组成达到联合国粮农组织(FAO)推荐的理想氨基酸组成值据我国营养状况调查报告发现,中国人摄入的核黄素含量存在严重不足问题。核黄素又称VB但现在研究核黄素的微生物发酵只限于制造胞外产品1材料和方法1.1材料表面1.1.1主试剂核黄素;腺嘌呤;25%Na1.1.2酵母ndidauntili面包酵母(Saccharomycescerevisiae)BY-1～8,假丝酵母(Candidautilis)CY-1～11,啤酒酵母(Saccharomycescarlsbergensis)SY-1～10,奶酒酵母(Saccharomycesuvarum)MY-1。以上菌种均为本实验室保藏菌种。1.2实验方法1.2.1酵母的制备从斜面接1环所测菌种于装有50mLYEPD液体培养基的250mL三角瓶中,30℃振荡培养24h。以10%的接种量转接至装有80mLYEPD的500mL三角瓶中,培养18h。取20mL发酵液,离心、洗涤,加入少量水(小于10mL),将酵母转入100mL棕色容量瓶中,加0.1mL冰醋酸,沸水浴0.5h,稍冷倒入离心管,以3000r/min离心10min。将上清液倒入10mL棕色容量瓶中定容。用反相高效液相色谱鉴定1.2.2还原糖法斐林试剂定糖法1.2.3ph测量精密pH计测定。1.2.4果汁蛋白的制备从斜面取菌种1杯接入装有80mLYEPD的500mL三角瓶中,30℃振荡培养48h收集酵母,烘干后将干酵母与水以1:9的比例混合,搅拌均匀,调pH5.5,并加助溶剂即干重0.1%的硫胺素和5%的葡萄糖和0.03%的木瓜蛋白酶(酶活力为95×101.2.5强制改变方法甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理1.2.6腺预防缺陷型菌株的筛选为切断核黄素进一步向腺嘌呤合成的代谢途径,解除支路代谢的反馈抑制,将出发菌株进行EMS诱变,用逐个挑选法按一定排列顺序分别对应点接于基本培养基和加有1g/L腺嘌呤的限制性培养基上,培养一定时间后,在限制性培养基上出现菌株,而在基本培养基相应位置却没有菌落生长。那该菌株可能是腺嘌呤缺陷型。将其挑入完全培养基中待测1.2.7腺嘌呤培养基的生长将所得到的合适的缺陷型菌株,再次进行诱变,将所得菌落分别点接于基本培养基和加有1g/L腺嘌呤的限制性培养基中,培养一定时间后,如果在限制性培养基上不生长,而在基本培养基相应位置却有菌落生长。该菌株可能是所要的回复突变株通过回复突变,一方面使有关合成腺嘌呤的酶系恢复了活性;另一方面使反馈抑制得到解除。1.2.8复突变株诱变为得到对无机氮源的不敏感菌株,进一步对回复突变株进行诱变。将诱变菌种涂布于所确定的铵离子临界浓度平板,培养一定的时间,挑选长得较大的菌落于YEPD完全培养基斜面待测1.3培养基1.3.1表面活性剂麦芽汁固体培养基,糖度12Brix,pH自然。1.3.2基本母系培养基葡萄糖20g/L,生物素20mg/L,(NH1.3.3yepd固体完全培养YEPD液体完全培养基加2%琼脂。1.3.4无氮基培养酵母基本培养基不加氮源。1.3.5二倍氮基本培养基在无氮基本培养基中加入2倍氮源,即(NH1.3.6限制基本功能基本培养基加上0.1%腺嘌呤。1.3.7发酵培养基葡萄糖5%,磷酸二氢钾0.02%,MgSO2结果与讨论2.1出发菌株的筛选对现有啤酒酵母(Saccharomycescarlsbergensis)SY-1～10、面包酵母(Saccharomycescerevisiae)BY-1～8、产朊假丝酵母(Candidautilis)CY～11和奶酒酵母(SaccharomycesuvarumMY-1,从核黄素和浸出物比率两项指标进行测定,挑选适宜的菌株为出发菌株。下面菌种在挑选指标上比同类菌株优越,现相互之间进行比较,结果如表1。从对BY-2,MY-1,CY-11,SY-3四种不同酵母的测定结果来看,MY-1菌株核黄素和自溶浸出率均为最高,是较为理想的出发菌株。2.2最佳菌株的确定为切断核黄素进一步向腺嘌呤合成的代谢途径,按照1.2.5方法进行诱变,挑得48株腺嘌呤缺陷型菌株,分别划斜面保存。以MY-1作为对照,分别测定测定核黄素含量,选出核黄素含量明显高于出发菌株MY-1的3株:M1-1、M1-3、M1-5,进一步测定其稳定性。结果如表2。从表2可以看出,诱变菌株M-3核黄素含量为162.01mg/kg,细胞生物量为14.038(g/L)。核黄素含量高于出发菌株MY-1约65.25%,且传代测定结果稳定。细胞生物量比出发菌株略低,但综合考虑确定M-3菌为进一步诱变的出发菌株。2.3胰腺磷酸酶回复突变植物的筛选2.4抗铵菌株的确定腺嘌呤缺陷型的回复突变株对无机氮源(铵盐)比较敏感,不利于工业生产。为了减少突变株对铵离子的敏感性,将回复突变株M2-8菌进一步诱变,涂布于临界浓度平板,得到抗铵菌株。初步测定得到4株核黄素含量较高的菌株,依次编号M3-17、M3-18、M3-19、M3-20。以M2-8号样为对照样,测定核黄素含量,结果如表4,由表可以看出,M3-20菌核黄素含量最高,比进一步诱变出发菌株M2-8核黄素含量高92.57%。因此,以核黄素含量为主要指标,确定M3-20为我们所筛选的目的菌株。2.5可靠性研究3突变株的确定(1)通过甲基磺酸乙酯诱变酵母菌种,能有效的提高酵母胞内核黄素的积累,突变株的核黄素含量与出发菌株相比提高了约215%。(2)选育的突变株能有效的在以铵盐为氮源合成培养基上生长,且遗传稳定性较好,适合工业化生产食用营养酵母。腺嘌呤缺陷型必须在含有一定腺嘌呤的培养基内才能生长,这对于大规模的工业生产不利。因此需培育腺嘌呤缺陷型的回复突变株。于是对M1-3菌株进一步诱变,挑选得到12株突变株依次编号M2-1、M2-2、……M2-12。对上述1