浙科版一轮公开课复习动物的克隆公开课一等奖课件省赛课获奖课件

动物克隆第1页动物细胞与组织培养克隆培养法单克隆抗体细胞核移植动物克隆常用技术动物细胞融合动物克隆技术基础是动物细胞与组织培养细胞工程主要伎俩是细胞培养和细胞融合第2页资料：培养细胞生存环境

1.无菌、无毒环境：添加一定量抗生素，定期更换培养液2.合适温度和PH：35-37℃;PH:7.2-7.43.气体环境（CO2培养箱）4.特殊培养液：主要有：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等调整PH，模拟人和哺乳动物细胞在体内最适环境思考：较植物组培培养基有何独特之处？1.液体培养基；2.葡萄糖.3、动物血清含激素，确保细胞顺利生长增殖第3页细胞全能性细胞株、细胞系植物体培养成果取得细胞或细胞产物培育新植株等培养目葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成份液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞和动物细胞培养比较第4页一、动物细胞培养首先，将动物体内一部分组织取出，通过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个细胞；然后，在人工控制培养条件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接触抑制和有规律衰老、死亡性能等生命活动现象。注意：细胞之间在生命活动中互相依存，因此也像体内同样展现一定组织特性。第5页细胞贴壁细胞贴壁：细胞培养时，悬液中分散细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。要求：培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒、易于贴附。在培养过程中，细胞会构造和功能变化第6页细胞在贴壁生长过程中,伴随细胞分裂,数量不停增加,最后形成一种单层,此时细胞间互相接触,细胞分裂和生长停顿。接触抑制第7页第8页成纤维细胞型：第9页思考几个问题1、在大多数细胞培养中都不直接使用人皮肤作为材料而是选用动物胚胎或幼龄个体器官或组织,为何？2、为何培养前要将组织细胞分散成单个细胞？3、胰蛋白酶作用？胃蛋白酶能够吗？4、为何要分装？5、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最后培养成新个体？培养细胞会因细胞密度过大和代谢消耗引发营养枯竭，不能正常生长。不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新动物个体由于这些组织或器官上细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养第10页有关概念原代培养：从机体取出后立即培养细胞为原代细胞。一般是指从开始到传至10代细胞培养传代培养：将原代细胞提成若干份，接种到其他培养基中，使其继续生长繁殖。传代培养一般指10-50代细胞培养第11页细胞原代培养

将动物机体多种组织从机体中取出，经多种酶（常用胰蛋白酶）或机械办法处理，分散成单细胞，置合适培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

第12页胰酶消化法1、取材：用手术剪将组织剪成小块（1mm2），再洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次.5、加入2ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）,用吸管吹打，冲散细胞。6、静置，使未分散组织块下沉。7、吸取上层细胞悬液，转移到两个培养皿中，补加适量培养液，37℃下培养。第13页（一）培养细胞生命期在培养中连续增殖和生长时间。

第14页1．原代培养期：从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段（初代培养）特点：细胞呈活跃移动、可见细胞分裂、形态构造和功能活动上与体内原组织相同性、多呈二倍体核型细胞群是异质，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。第15页2．传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期连续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐迟缓，以至完全停顿，细胞进入第三期。第16页3．衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种原因影响，细胞也许发生自发转化。转化标志之一是细胞也许取得永生性或恶性。第17页细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工办法诱发，转化后细胞也也许具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。第18页细胞悬液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养总结多呈二倍体核型细胞群是异质传代后称做细胞系转化细胞也许取得永生性或恶性—异体致瘤永生性也称不死性，又称无限细胞系，也称连续细胞系，大多变成异倍体有限细胞系（二倍体）第19页细胞系、细胞株细胞株：通过一定选择或纯化办法，从原代培养物或细胞系中取得具有特殊性质细胞，称为细胞株。特点：一般具有恒定染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等。连续细胞株：能够连续数次传代有限细胞株：可传代次数有限细胞系：异质性细胞株：纯系第20页★如何取得纯系细胞系？把一种细胞从群体中分离出来单独培养（克隆培养法）第21页二、克隆培养法1、克隆培养法概念：把一种细胞从群体中分离出来培养，使之繁殖成一种新细胞群体技术。（克隆培养与群体培养是一种等位概念）2、特性：纯系（遗传性状均一、体现性状相同）3、基本要求：必须确保分离出来细胞是一种而不是多种。4、克隆难易程度:单细胞不如群体细胞原代细胞、有限细胞系＜连续细胞系、转化或肿瘤细胞5、提升克隆形成率措施：选择合适培养基、添加血清（胎牛血清）、滋养细胞（如经射线照射本身是去增值力小鼠成纤维细胞）、激素（胰岛素等）刺激、CO2培养箱、调整PH值等6、用途：如从一般细胞系中分离出缺乏特殊基因突变细胞系。第22页三、动物细胞融合技术及其应用★

什么是细胞融合技术？★

为何要进行细胞融合？★

如何实现细胞融合？第23页

定义

指用自然或人工办法,使两个或多种不一样细胞融合成一种细胞过程。

不一样基因型细胞之间融合就是细胞杂交。1、动物细胞融合受精作用两个细胞正在融合第24页

诱导融合原因生物法：灭活仙台病毒诱导融合利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有。这是由于病毒磷脂外衣与动物细胞膜十分相同缘故。病毒外壳上某些糖蛋白也许尚有促进细胞融合功能。化学法：聚乙二醇诱导融合由于聚乙二醇易得、简便，且融合效果稳定，是目前应用最广泛办法。物理法：电刺激诱导融合病毒颗粒黏附细胞表面细胞膜连接细胞膜被病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞第25页5、应用1.由于细胞杂交中染色体容易丢失，因此利用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物减少对应关系，能够进行基因定位。3.利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。2.克服远缘杂交不亲和障碍鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡、人—胡萝卜等此技术有什么缺陷和长处？第26页小鼠单克隆抗体制备第27页杂交瘤制备融合前准备工作细胞融合杂交瘤细胞筛选单克隆抗体大量制备第28页主要设备

净化工作台

超净工作台是一种无菌操作装置，其原理是内设鼓风机，驱动空气通过高效滤器净化后，让净化后空气渐渐通过台面空间，使工作场地组成无菌环境。组织培养材料准备第29页主要设备

CO2恒温培养箱

骨髓瘤和杂交瘤细胞培养都需要在恒定温度条件下才能生存，温度变化一般不应超出0.5度。因此要求培养箱应具有较高敏捷度；电热恒温箱质量关键在于控温装置优劣。CO2恒温培养箱已成为普遍应用设备，长处是箱内能恒定地提供一定量二氧化碳，一般用5%，可使培养液维持稳定pH，减少调pH麻烦。组织培养材料准备第30页主要设备

离心机培养细胞经常需要制备细胞悬液、漂洗，需离心分离细胞，要求每分1000转左右，故一般小型台式离心机即符合要求。组织培养材料准备第31页主要设备

培养液过滤装置

多种培养用液只能用过滤办法进行除菌做消毒处理。现多用微孔滤膜，密度有不一样型号，尺寸有不一样规格。组织培养材料准备第32页主要设备

多孔培养板、塑料器皿

组织培养材料准备第33页骨髓瘤细胞悬液制备骨髓瘤细胞扩大培养50ml离心管1000r/min离心5-10min离心洗涤骨髓瘤细胞悬液活细胞计数后备用融合前48-36h融合当天30ml不完全培养基10ml不完全培养基0.4%台盼蓝染液

第34页脾细胞悬液制备小鼠脾脏直径10cm平皿剥离周围结缔组织

剪刀剪碎、注射器芯挤压单细胞悬液直径10cm平皿10ml不完全培养基

铜网过滤

10ml不完全培养基

轻轻洗涤

第35页脾细胞悬液制备脾细胞悬液1000r/min离心5-10min离心洗涤1-2次脾细胞悬液活细胞计数后备用50ml不完全培养基10ml不完全培养基0.4%台盼蓝染液

第36页1234mmmm12341234单克隆抗体细胞融合取出脾细胞+癌细胞各抗体分开传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234B细胞抗原免疫小鼠后，其脾脏会产生分泌抗体多种B细胞。每种B细胞只能分泌一种抗体，反抗各自抗原决定基。传统抗血清便是所有抗体混合，得以有效保护动物个体。假如能够把单一种B细胞挑出来培养，则可收获单一种抗体。不过，B细胞无法在试管中培养生长。癌细胞可以在试管中连续培养生长，但无法产生所要抗体。这些单独融合细胞能够大量生产单独一种抗体，就是单克隆抗体。若把B细胞与癌细胞融合，所得到融合细胞则可分別培养。第37页骨髓瘤细胞致敏B淋巴细胞杂交瘤第38页骨髓瘤细胞脾细胞杂交瘤细胞融合后细胞类型:

杂交瘤技术理论基础融合细胞筛选技术第39页融合细胞筛选技术生化代谢缺陷型骨髓瘤细胞系单克隆抗体产生原理HAT培养基根据筛选杂交瘤细胞特殊培养液。

第40页融合后细胞在HAT培养基中存活情况不能长期生长死亡生化代谢正常能够长期生长生长繁殖死亡生化代谢缺陷能够长期生长生化代谢正常第41页杂交瘤细胞筛选

脾细胞骨髓瘤细胞细胞融合HAT初步筛选筛选阳性克隆单克隆抗体产生原理第42页操作步骤筛选阳性细胞克隆每孔加待检杂交瘤细胞培养上清，同步设置阳性（免疫鼠血清）、阴性对照（完全培养基）和空白对照。第43页单克隆抗体大量制备动物体内生产法体外培养法小鼠腹水诱导细胞培养液第44页制备杂交瘤培养上清

杂交瘤细胞扩增1:10百分比转入新瓶离心、搜集上清检测抗体滴度分装、无菌保存

37℃5％CO2

5d

第45页制备单克隆抗体腹水

动物体内生产单抗是最实用大量制备单抗办法。使用动物首选BALB/c小鼠。原理：将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量腹水单抗且抗体浓度很高。注射细胞前一般先用降植烷或液体石蜡处理腹腔，方便产生大量腹水。缺陷：腹水中常混有小鼠多种杂蛋白（包括Ig）；有污染动物病毒危险。第46页制备单克隆抗体腹水

腹腔接种降植烷或液体石蜡（0.5-1ml/只）

7-10天腹腔接种无血清培养基稀释杂交瘤细胞，5×105/只

第47页制备单克隆抗体腹水

7-10天采集腹水2023r/min，5min搜集上清，测定抗体效价分装，冻存备用

第48页第49页思考：（1）为何用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？

细胞同源性越近，融合形成杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞遗传物质，不但具有B细胞分泌抗体能力，并且尚有没有限增殖本事，因而能够取得大量单克隆抗体。（2）骨髓瘤细胞是癌细胞吗？有没有限增殖能力细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力肿瘤细胞，称为癌细胞，因此瘤细胞不能等同于癌细胞。（3）制备过程为何要通过两次筛选？

第一次筛选取得多种杂交瘤细胞第二次筛选出特异抗体杂交瘤细胞。(5)本过程利用了哪些原理？免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理（4）制备过程中应用哪些细胞工程技术伎俩？

细胞融合技术、细胞培养技术。第50页动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂交瘤细胞才能活动物细胞培养技术取得产生对应抗体B淋巴细胞取得能产生所需抗体杂交瘤细胞取得杂交瘤细胞第51页1975年，米尔斯坦（英）和科勒（德）融合选择性培养基抗体检测问题探究1.第一次筛选和第二次筛选目标有何不一样？2.单克隆抗体有何特点？单克隆抗体长处：化学性质单一，特异性强，敏捷度高。第一次筛选：用选择性培养基取得杂交瘤细胞。第二次筛选：通过抗体检测取得能产生所需抗体杂交瘤细胞。第52页四、动物克隆繁殖★理论上，分化动物细胞能像植物细胞同样脱分化、再分化成一种动物体吗？★动物细胞事实上体现出全能性情况如何呢？第53页受精卵>胚胎干细胞>多能干细胞>单能干细胞>体细胞四、动物克隆繁殖（一）动物细胞全能性体现程度如多能造血干细胞：可分化为红细胞、白细胞、血小板等（2）低等动物细胞：全能性一般容易体现。如水螅上皮细胞，不通过度裂就能够转变为上皮、肌肉细胞。（1）高等动物细胞第54页（二）动物难以克隆主线原因

在动物个体发育过程中，分化成果使得细胞在形态和功能上高度特化，这是由于细胞在伴伴随它们发育过程中在时间、空间变化，基因体现调控使得细胞中合成了专一蛋白质。动物基因组中，一类基因是维持生存，在多种细胞中都处于活动状态。另一类基因伴随组织器官和发育阶段不一样而选择性体现。分化细胞内基因活动很不完全，因此很难像受精卵那样发挥细胞全能性。第55页胚胎细胞核移植成功率远高于成体细胞(三)细胞核移植试验和动物克隆繁殖1、过程：利用一种细胞细胞和来取代另一细胞中细胞核，形成一种重建“合子”胚胎细胞核移植体细胞核移植第56页绵羊“多莉”克隆过程：第57页详细操作取6岁母绵羊（芬兰多塞特白品种绵羊）乳腺细胞作核供体细胞，用“饥饿法”使其进入休眠状态而使所有基因具有活性。注射促性腺激素GN促使母羊（苏格兰黑面母绵羊）排卵，28－33小时取其未受精卵迅速去核，放入10%FCS（小牛血清）、1%FCS和0.5%FCS连续5天，饥饿使进入G0期做受体细胞。

第58页在乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电流作用下，将乳腺细胞核融入卵中，形成一种具有新遗传物质卵细胞。将新卵细胞发育成桑椹期胚胎或囊胚，再移入假孕母羊子宫内。产下多莉即为6岁母羊复制品，也为白色。第59页①供体和受体准备核移植成功主要前提：尽可能确保核供体和受体细胞处于同样细胞周期（同步状态）

如何使处于细胞周期不一样阶段上核供体和受体处于同步状态？第60页饥饿技术即在供体细胞培养基中减少营养物质（血清）浓度，使供体细胞处于“饥饿状态”，停顿分裂增殖而休眠。休眠细胞核进入去核卵细胞后，在卵细胞细胞质作用下重新启动分裂程序。这样，供体细胞核与受体细胞质才能在分裂相上互相协调，配合细胞才能分裂发育。第61页②去卵膜和卵核如何给受体细胞去核？◆显微操作

◆紫外照射◆细胞松弛素结合高速离心

第62页第63页③供体细胞制备如何获取供体细胞核？◆

显微操作

◆细胞松弛素结合高速离心核体胞质体第64页二、克隆技术办法将受体卵细胞

去核向去核卵细胞植入供体细胞移植后细胞激活后能够象受精卵同样发育形成动物个体，并具有与核供体细胞相同基因④移核第65页⑤移植后重组细胞激活、培养、胚胎移植◆激活（P52）（使卵母细胞从MII期解放，转到“受精”状态）◆重组胚体内或体外培养◆胚胎移植

第66页重构卵激活正常情况下,受精过程中，精子进入卵子后,卵母细胞质中会出现一系列反应,如母源性mRNA启动转录等。这些反应是卵母细胞被激活标志，不通过这些变化,胚胎就不能正常发育。核移植过程中激活就是模仿受精过程中精子刺激作用。目前，激活方式主要有：电激活和化学激活第67页显微操作法进行细胞核移植第68页克隆羊成功分子细胞生物学机理：

供体核DNA中有起源于乳腺细胞细胞质调整蛋白，它制止了核基因体现。重组卵细胞，基因转录没开始，无调整蛋白重组移核细胞丢失了源于乳腺细胞调整蛋白。通过三次分裂后，原乳腺细胞调整蛋白便所有被卵细胞质中蛋白因子替代了，因此核DNA被重新编排，细胞开始体现自己基因。第69页体细胞克隆成功意义：1、证明了高度分化细胞也能够回复到类似受

精卵时期功能。2、证明了细胞质具有调控细胞核发育作用。应用：

为遗传疾病治疗、优良品种培育等提供了主要途径；对濒危动物保存也有主要意义。克隆成功条件（必备基础）P201、具有包括物种完整基因组细胞核活细胞。(如乳腺上皮细胞)2、能有效调控细胞核发育细胞质物质。（如去核卵细胞