程序性gcfdna检测在肾移植中的应用

程序性gcfdna检测在肾移植中的应用

肾移植是肾衰竭患者的首选治疗方法。与长期透析相比，肾移植后患者的生存率更高。目前，在我国用于临床检测移植物损伤的方法主要包括常规肾功能指标和病理学组织活检。然而，常规肾功能指标如肌酐，其灵敏度和特异性不高，无法准确判断移植物损伤状况为了探索体液活检GcfDNA在亲体肾移植和尸体肾移植受者中长期程序性监测的意义，我们对术后亲体肾移植和尸体肾移植受者进行了一项前瞻性单中心队列研究。并分析了亲体肾移植和尸体肾移植受者中相应时间点[术后第10天（D10）、第1个月（M1）、第3个月（M3)]GcfDNA拷贝数、GcfDNA百分比和肌酐，以此评估GcfDNA在肾移植术后长期程序性检测的意义。1数据和方法1.1血清心肌指标在2021年1月至2021年9月期间，前瞻性地纳入在四川省人民医院器官移植中心接受亲体肾移植和尸体肾移植的受者。供体的基线资料包括年龄、性别、捐献前肌酐/单侧肾小球滤过率、热缺血时间、冷缺血时间、配型信息。受者的基线资料包括年龄、性别、术前相关疾病、诱导免疫抑制方案和手术后并发症，同时记录了供受者血型以及HLA错配数。在D10、M1、M3程序性采集受者的血GcfDNA，并在相同时间点检测受者的血清肌酐水平。对受者的随访时间最长为6个月，最短为1个月。经四川省医学科学院·四川省人民医院医学伦理委员会审查通过[伦审（研）2021年第483号]。1.2gcfcd-pcr检测gcfcda部分的检测方法，基于单碱基差异的检测方法，将n第1款pcr检测根据制造商的说明，使用NucleoSnapDNA血浆试剂盒（MN，德国）从4ml血浆中分离出循环无细胞DNA(cfDNA）。用50μl无核酶水从自旋柱中洗脱cfDNA，浓度约为10～30ng/μl，然后利用成都仕康美生物技术有限公司的“GraftsentinalGcfDNA百分比的测量（%）：随着以PCR或二代测序为基础的高敏感性、高通量检测技术的应用，人们基于供体-受者间的基因多态性的不同，如人类白细胞抗原不相合、拷贝数改变、单核苷酸多态性等GcfDNA拷贝数的定量（cp/ml）：由于供者和受者的同一基因片段存在单碱基差异，设计特异性探针，经过ddPCR绝对定量及校正，得到供者和受者同一基因片段（单碱基差异）的拷贝数。通过将样品中cfDNA的总浓度（cp/ml）乘以GcfDNA分数（%），可以计算出每毫升血浆中单倍体GcDNA基因组拷贝的绝对定量（cp/ml）。1.3统计分析方法分类数据以计数或百分比（%）表示，连续数据显示为均数±标准误（x±se），有序数据显示为中位数和四分位区间，所有临床数据结果均采用t检验或单因素方差分析进行统计分析。使用卡方检验或Fisher精确检验对类别变量进行检验，以观察两组之间的差异。Mann-WhitneyU检验用于比较非参数连续变量。使用KolmogorovSmirnov检验对所有连续变量的正态性进行了检验。Pearson相关性分析用于多个变量是否相关。本研究的所有统计分析均使用GraphpadPrism软件进行。P值<0.05有统计学意义。2结果2.1亲体移植和接受程序移植者的年龄和bmi、hla配数、冷日本热日本缺血量尸体移植受者51例（58.62%），亲体移植受者36例（41.38%），尸体移植受者中1例为二次移植。亲体移植的供体大多为女性（58.33%），但尸体移植的供体大多为男性（74.5%）。亲体移植的供体年龄和BMI显著高于尸体移植的供体年龄和BMI(51.89比41.39,P<0.001;23.41比21.66,P<0.01），捐献前供体肌酐在亲体移植中明显低于尸体移植（42.13比108.40,P<0.001）。接受尸体移植的受者平均年龄显著性高于接受亲体移植的受者（40.67比35.25,P<0.01）。同时接受亲体移植受者的HLA错配数、热缺血时间和冷缺血时间均显著低于接受尸体移植受者（P<0.001）。其他供受者相关的人口统计学信息在亲体移植和尸体移植中均无显著性差异（表1）。2.2cp/ml与mt6思想分别于D10、M1、M3、M6进行程序性检测测定GcfDNA拷贝数和GcfDNA百分比。GcfDNA拷贝数在D10为0.70cp/ml,M1为0.40cp/ml,M3为0.32cp/ml,M6为0.25cp/ml，并有显著性差异（P<0.05）。GcfDNA百分比在D10为0.60cp/ml,M1为0.50cp/ml,M3为0.30cp/ml,M6为0.30cp/ml，并有显著性差异（P<0.05），而在相同时间点测定的肌酐和肾小球滤过率均无显著性差异（图1）。2.3gcfcd-pcr检测亲体移植受者D10的GcfDNA拷贝数为0.45cp/ml低于接受尸体移植受者0.90cp/ml，并有统计学差异（P<0.05），并观察到尸体移植受者的GcfDNA拷贝数在D10与M1有显著性差异（P<0.05），两组受者的GcfDNA拷贝数均随时间延长呈现下降趋势（图2A）。GcfDNA百分比仅在M1时有显著性差异，亲体移植受者为0.40%低于接受尸体移植受者0.60%(P<0.05），亲体移植受者的GcfDNA百分比随时间延长呈现下降趋势，但尸体移植受者在M6时相较于M3有升高（图2B）。在D10检测到的肌酐和肾小球滤过率在两组之间均有显著性差异，值得注意的是，亲体移植受者的肌酐呈上升趋势并在M1和M3时间点有显著性差异，而肾小球滤过率在亲体移植受者中呈下降趋势，并分别在D10和M1、M1与M3时间点之间有显著性差异（P<0.05）（图2C、D）。2.4肌肉注射和gcfd-m6的相关性分析分析相同时间点肌酐与GcfDNA的相关性（D10、M1和M3），在D10和M1时，肌酐与GcfDNA拷贝数和GcfDNA百分比均无显著相关性（P>0.05）；在M3时，肌酐与GcfDNA拷贝数呈显著性负相关Y=-24.49×X+131.50(r=-0.33,P=0.04），与GcfDNA百分比也呈显著性负相关，线性回归方程为Y=-30.72×X+133.30(r=-0.34,P=0.03）（图3）。同时由于M6数量较少并未分析其相关性。分析在M3肌酐与GcfDNA拷贝数和GcfDNA百分比呈负相关，排除了会严重干扰GcfDNA水平的因素后，肌酐与GcfDNA拷贝数和GcfDNA百分比无相关性。2.5bk输注后gcfcdna检测在前瞻性研究期间，有6例受者发生了感染。P1在M4发生耶氏肺孢子菌感染，P4在M1发生了卡氏肺孢子菌、巨细胞病毒感染以及人类细小病毒B19感染（B19),P14在M3发生了BK感染，P49在M1发生了B19及巨细胞病毒感染，P65在术后第14天发生了B19感染，P82在M1发生了BK感染。P4在M6时其GcfDNA拷贝数以及GcfDNA百分比水平相较于M3时出现明显上升，P49的GcfDNA拷贝数从D10的0.37cp/ml上升到M1的1.6cp/ml，但其GcfDNA百分比水平却大幅度下降，P65在M1时其GcfDNA拷贝数以及GcfDNA百分比水平相较于D10时有上升。其中1例受者P7在M3时考虑细胞急性排斥反应，但是病理活检结果为急性小管损伤，非细胞急性排斥反应并且没有任何免疫损伤，P33在M2时经活检穿刺证实为临界性急性T细胞介导性排斥反应，虽经激素冲击后有所好转，但是在M3时其肌酐再次升高。8个病例具体的GcfDNA拷贝数、GcfDNA百分比、肌酐和并发症见表2。3程序性gcfcd检测在当前，尚缺乏早期检测移植肾损伤的体液标志物。血清肌酐的水平受到多种因素的影响，如过度运动、血管紧张素转换酶抑制剂、药物毒性等，因此，利用血清肌酐无法准确判断移植肾损伤的情况既往多项研究表明，GcfDNA百分比在移植术后立即达到高值（>cfDNA总数的5%），并在1周内迅速下降至<0.5%接着在监测评估不同类型的肾脏移植GcfDNA时发现，D10的尸体肾移植组GcfDNA拷贝数显著性高于亲体肾移植组（P<0.05）。有研究表明，在最初时，尸体肾移植组中GcfDNA水平（44.99%）显著高于亲体肾移植组中GcfDNA水平（10.24%),P<0.01在观察GcfDNA与肌酐的线性关系时，发现它们之间的线性相关性较差，存在一定程度的非线性相关，GcfDNA拷贝数为独立的评价肾功能的指标，不会受到肌酐波动的影响。提示GcfDNA与传统的指标不同，可潜在作为评价肾移植术后移植物功能状况的独立指标。同时，在D10、M1和M3均检测到GcfDNA>1%的情况，根据既往文献提示移植肾可能有排斥反应的风险。但截至当前随访，这些受者皆未被确诊为排斥反应，我们后续将继续跟踪这些数据，获取全面的随访资料。在程序性检测过程当中，共6例受者发生了感染（耶氏肺孢子菌感染、卡氏肺孢子菌和巨细胞病毒感染）而无伴发排斥反应，其GcfDNA均为下降趋势，同时临床上做了相应的病理活检，受者P14病理检测提示为BK病毒相关肾病B期，虽然有研究表明尿GcfDNA水平升高可能有助于鉴别BK多瘤病毒感染肾移植受者中的BK多瘤病毒相关性肾病综上所述，初步探索程序性GcfDNA检测在肾移植中已有以下几点意义：首先，在对肾移植进行程序性检测时推荐术后10d开始启动，并定期进行检测延长时间。其次，与肌酐或活检相比，GcfDNA拷贝数具有作为创伤的非侵入性且可能是更敏感的生物标志物的优势，但缺乏关于损伤类型的特异性。最后，GcfDNA拷贝数是独立评价肾功能的指标。但是本研究也存在一定的局限性，该研究为单中心研究并且样本量过少，存在一定的偏倚性和不准确性，同时并未对纳入的每例患者都做病理活检且无金标准，最后由于受者依从性低无法让每例受者都完成完整的程序性检测，在第6个月时检测到的GcfD