基于ssr分子标记构建的平菇种质分子身份证

基于ssr分子标记构建的平菇种质分子身份证

扁平是一种具有悠久历史和广泛栽培范围的食用菌。平菇原专指糙皮侧耳(Pleurotusostreatus),现常将侧耳属几个可以栽培的近缘种泛称为平菇近年来,分子生物学手段因具有不受环境影响且变异丰富等优点,被广泛应用到食用菌菌株鉴别中来1材料和方法1.1生长和抗性试验结果供试菌株为河北省主栽平菇品种,来源于科研单位或菌种公司。经多年的栽培试验测试,17个平菇品种均表现为稳定而特异的表型性状,并且拮抗试验显示17个菌株两两之间均有拮抗。供试菌株的品种名称和来源见表1。1.2dna的提取将活化好的平菇菌种块转接至铺有玻璃纸的PDA平板上,25℃暗光培养5d,刮取新鲜菌丝体100mg左右,加入液氮研磨,按照植物基因组DNA提取试剂盒(购于天根生化科技有限公司)说明,提取基因组DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取的DNA浓度和纯度。将DNA浓度稀释至20ng·μL1.3co1的扩展和分析参考黄晨阳1.4全基因组序列从JGI数据库中搜索并下载PleurotusostreatusPC15v2.0全基因组序列(/PleosPC15_2/PleosPC15_2.download.html)。利用SSRLocator软件对其全基因组序列进行单至六核苷酸重复SSR序列的查找1.5ssr引物筛选选取4个平菇菌株的基因组DNA为模板进行SSR引物初筛。SSR-PCR反应体系:总体积20μL,包括10×PCRbuffer2μL,25mmol·L1.6菌株相似度分析根据4个菌株扩增结果筛选出扩增条带清晰、稳定、多态性丰富且区分度高的SSR引物。分别对17个供试菌株进行扩增试验。根据供试菌株的扩增图谱,参考每个引物扩增目的片段的分子量大小,将强带或可分辨/重复性好的弱带记为有效的等位基因谱带,重复性不好的弱带不考虑,由小到大依次统计等位基因谱带,分析每对引物对17个菌株扩增产生的带型,并对不同带型进行赋值编码,标记为1~9。为了保证每位编码只有1位数字,第10种带型标记为0,将菌株带型转成零一矩阵,采用NTSYS-2.10e软件计算同一物种菌株间相似度。根据菌株间相似度分析结果,如果存在相似度为100%的菌株,则需设计新的SSR引物进行扩增,直至17个菌株的相似度小于100%,即将17个菌株全部区分开。根据带型编码构建17个平菇品种的SSR分子标记身份证。2结果与分析2.1opiae检测结果CO1扩增结果见图1。17个菌株均能扩增得到单一条带,根据条带大小,供试菌株分为3组。第2号、第9号、第12号和第16号菌株为P.ostreatus,共4株;第3号、第4号、第6号、第8号、第10号、第11号、第14号和第15号菌株为P.cornucopiae,共8株;第1号、第5号、第7号、第13号、第17号菌株为P.pulmonarius,共5株。2.2ssr扩增多态性分析根据4个菌株对48对SSR引物的筛选结果,经过多次扩增试验验证,最终选取9对扩增条带清晰、稳定、多态性丰富且区分度高的SSR分子标记,见表2。这九对SSR分子标记所对应的SSR位点分别分布在PleurotusostreatusPC15v2.0全基因组12条scaffold的第3条~第8条上。9对SSR标记在17个平菇菌株中共检测到52个等位基因。不同SSR标记检测到等位基因数目范围为3个~8个,平均检测效率为5.8个/标记,扩增的等位基因谱带片段大小见表3。各位点的多态信息含量(PIC=1-∑Pi进一步根据9对引物对17个菌株扩增的分子指纹图谱,将带型转成零一矩阵,计算同一物种内菌株间的相似度。4株P.ostreatus菌株间的遗传相似性系数为0.44~0.89,8株P.cornucopiae菌株间的遗传相似性系数为0.48~0.85,5株P.pulmonarius菌株间的遗传相似性系数为0.33~0.93,说明这九对SSR引物可以将17个平菇品种完全区分开。2.3分子身份证构建9对引物在17个菌株中共产生53种带型,其中在P.ostreatus组中检测到18种、P.cornucopiae组27种、P.pulmonarius组27种,不同物种的菌株间可以产生相同的带型。9个引物分别扩增的带型数为4种~10种。引物P25扩增的带型数最多为10种。图2为引物P4对17个菌株扩增产生的全部带型和赋值情况,共有6种带型。每对引物产生的不同标准带型和赋值情况见表3、表4。对17个供试菌株的分子身份证进行编码,每个菌株的分子身份证分别由9个字符串组成,从左到右依次代表引物P3、P4、P12、P14、P22、P23、P25、P26、P34产生的第几种带型,结果见表5。从表5可以看出,17个平菇品种分别具有特异的分子身份证编码。3讨论3.1ssr引物筛选对于SSR分子身份证的构建方法,不同的研究者有不同的编码原则。于潇等本研究选取9对SSR引物对17个菌株扩增结果显示,大部分菌株都是杂合带型,即包括两个以上的等位基因,这可能是由于平菇栽培过程中容易产生孢子而发生自然杂交3.2在平行研究中，ssr分子标记的应用SSR分子标记多用于平菇种质资源遗传多样性分析及菌株鉴定等研究3.3侧耳属物种p.cornucopiae在我国,不同地区称谓的平菇所指