不同松树接种松材线虫后no和核酸酶活性的变化

不同松树接种松材线虫后no和核酸酶活性的变化

松草病是松草病引起的一种综合性疾病。这种疾病在中国许多省份都很流行，给森林和生态系统以及经济发展带来了重大损失。由于松材线虫的致病机制以及松树的抗病机制尚未明确,这给松材线虫病的防治带来了困难。国内外学者在松材线虫病的致病机制、组织病理学和病理生理学等方面做了大量研究(刘军民等,1995;金钢,2007;厉艳,2008),很多研究表明松树与松材线虫互作早期某些次生代谢物质的快速变化与松树的抗病性有直接关系,有些可诱导松树的防卫反应(Sugaetal.,1993),并与松材线虫病的发展趋势一致。近年来,大量研究表明一氧化氮(NO)是调控植物抗感病信号的重要信号分子(Gouveaetal.,1997)。许多报道证实NO可参与大豆(Glycinemax)-假单胞菌(Pseudomonassp.)、烟草-TMV和拟南芥(Arabidopsisthaliana)-丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)的抗病信号转导(Wendehenneetal.,2004)。此外,NO偶联于cGMP,促进cADP核糖(cADP-ribose,cADPR)的合成,后者是有效的钙离子激活剂,偶联于胞内钙通道,激活第2信使钙离子的释放,诱导寄主细胞过敏性反应(Clarketal.,2000)。NO还能和活性氧互作共同诱导细胞过敏性反应和细胞膜质过氧化(Durneretal.,1998),这些均是植物抗病反应中的关键性生理生化过程。刘劼等(2008)研究认为超氧自由基可能在松树与松材线虫互作早期具有重要作用。同时,有关植物细胞程序性死亡(PCD)的研究发现植物PCD发生与多种核酸酶相关。一些研究结果表明核酸酶可能参与植物细胞的分化、过敏性反应、胁迫反应、抗逆反应和叶片老化等过程,并在其中起着重要作用(Neilletal.,2003;Mittleretal.,1997)。但有关NO和核酸酶在松材线虫病中的作用研究鲜见报道。前人研究表明不同松树品种对松材线虫的抗性与植物抗病反应(细胞过敏性反应和膜脂过氧化)有密切关系(陈玉惠等,2002)。大量研究表明:火炬松(Pinustaeda)对松材线虫表现为高度抗病,马尾松(P.massoniana)中度感病,黑松(P.thunbergii)高度感病(杨宝君等,1993)。不同抗性松树与松材线虫互作中NO和核酸酶的变化规律是否一致,其变化是否与松树的抗性存在一定的相关性至今未见相关研究报道。本研究以火炬松、马尾松和黑松为研究对象,比较不同抗性松树接种松材线虫后内源NO和核酸酶变化的差异,以期弄清NO和核酸酶在该互作体系中的功能作用,为阐明松材线虫病的致病机制和松树的抗病机制提供一定的参考依据。1材料和方法1.1接种苗的制备松材线虫17#虫株采自江苏连云港黑松。采用贝尔曼漏斗法分离纯培养保存的松材线虫,将获得的线虫用0.1%硫酸链霉素表面消毒5min,再用无菌水洗涤3次后,移置长满灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的PDA平板上。25℃培养箱中培养7天,用于接种试验。供试松苗为3年生、生长较一致、健康的马尾松、黑松和火炬松盆栽苗(采自安徽),平均苗高和地径分别约为30cm和2cm。采用人工皮接法(方中达,1998)接虫,接种点为苗高20cm处松茎。供试松材线虫接种量均为每毫升6000条,接种后棉球保湿12h,然后置于30℃、16h·d1.2黑松no含量检测各处理松苗于接种后4,12,24,48,72,96和120h分别取各处理松苗接种部位以上1cm处针叶,剪碎、混匀后各称取1.2g。用液氮研磨,然后加入8.4mL预冷的磷酸缓冲液(PBS)(pH7.4,10mmol·LNO检测采用硝酸还原酶法,采用购自南京建成生物工程研究所(批号20090627及20090704)一氧化氮检测(硝酸还原酶法)试剂盒对黑松体内的NO含量进行检测。NO测定按试剂盒说明书操作。1.3研磨法制备核酸酶活性分别取各处理松苗接种部位以上1cm处针叶1g放入先用液氮冷却好的干净研钵里研磨,然后加入2.5mL冷却的50mmol·L核酸酶活性测定参照Wood等(1998)方法。单链DNA由小牛胸腺DNA水溶液(1mg·mL1.4数据处理和分析将所获得的各数据采用SPSS13.0在显著水平P=0.05下进行统计学分析。2结果与分析2.13种松树与松材线虫互作中no含量的变化经测定,3种松树健康状态下(CK2)针叶内NO平均含量为:火炬松2130.30μmol·g3种松树在割伤只接无菌水(CK1)的处理中,火炬松和马尾松针叶内NO含量在4h时较其健康状态值都有所升高,火炬松升高幅度比马尾松大,而黑松基本与其健康状态值持平;在24h时,3种松树CK1的NO含量迅速下降,都低于其健康状态;48h时黑松和马尾松CK1处理的与其健康状态基本持平,而火炬松CK1处理的NO含量较其健康状态有所升高;72～120h时黑松和马尾松的CK1处理有所升高(高于其健康状态),但变化幅度较小,而火炬松CK1处理的有所下降,低于其健康状态(图1a)。3种松树感染松材线虫后4～24h,黑松针叶内NO含量先升后降,火炬松和马尾松的一直处于下降趋势;在12h时3种松树体内的NO含量为黑松>马尾松>火炬松且差异较明显,并在24h达到显著差异。与其割伤仅接无菌水的处理(CK1)相比,黑松和和马尾松针叶内NO含量都明显高于其CK1,而火炬松低于其CK1。48h时,3种松树针叶体内NO含量都开始升高,黑松较其CK1升高67%,马尾松较其CK1升高16%,火炬松较其CK1升高9%;此时3种松树体内的NO含量差异显著,为黑松>马尾松>火炬松,但这种差异在48h后不明显。可见松树受侵后的4～48h阶段可能是松材线虫病发生发展的一个关键时期。48h后,3种松树针叶内NO含量继续升高且明显高于其CK1,其中火炬松在72h达到其峰值(高于其CK1约66.4%);黑松和马尾松在96h达到峰值(分别高于其CK1约17%和39.1%),较火炬松晚24h(图1b,c)。由此可见,在接种后期(72～120h)火炬松NO峰值比黑松和马尾松出现早,且3种松树较其CK1升高幅度为火炬松>马尾松>黑松。这说明在接种后期松树针叶内NO峰值出现的先后及较割伤只接无菌水处理上升幅度的大小与松树的抗性存在正相关。2.2种松树与火炬松单链核酸酶活性的比较黑松、马尾松和火炬松在健康状态下针叶内单链核酸酶的平均活性无显著性差异(图2a)。割伤处理(CK1)后3种松树针叶内的单链核酸酶变化在4～12h存在差异:4h时单链核酸酶活性火炬松>马尾松>黑松;12h时火炬松的单链核酸酶活性下降,而黑松和马尾松的处理则有所升高,基本处于同一水平,并高于火炬松;在12h后3种松树割伤处理的单链核酸酶活性无显著差异,但24h后火炬松一直稍高于马尾松和黑松(图2a)。这说明火炬松对伤口的反应比马尾松和黑松更敏感。3种松树接种松材线虫后,4h时针叶内单链核酸酶活性大小依次为:火炬松、马尾松、黑松,与其各自割伤处理(CK1)相比,黑松升高50%,马尾松升高15%,火炬松升高13%。12～48h,火炬松针叶内单链核酸酶活性的上升幅度比黑松和马尾松的都高,48h时3种松树体内单链核酸酶的活性大小依次为:火炬松、马尾松、黑松;48～72h,黑松的单链核酸酶活性迅速升高并达到峰值(较仅割伤处理的高205%),而马尾松和火炬松的呈下降趋势。120h时,火炬松和马尾松针叶内的单链核酸酶迅速升高,而黑松则迅速下降(见图2b,c)。由此表明,3种松树接种松材线虫后,其针叶内单链核酸酶的变化与松树的抗病性存在一定的相关性,尤其在24h时表现最为明显。2.3种松树与松材线虫互作中双链核酸酶的变化黑松、马尾松和火炬松健康状态下针叶内双链核酸酶活性变化幅度较小,其平均值无显著性差异(图3a)。3种松树割伤只接无菌水的处理双链核酸酶活性在12h后都有所升高;至24h为黑松>火炬松>马尾松,随后黑松迅速下降,火炬松则有所升高;48h时为火炬松>马尾松>黑松;48h后3者无显著差异(图3a)。3种松树感染松材线虫后,其针叶内双链核酸酶活性变化趋势存在明显差异。4h时,针叶内双链核酸酶的活性大小依次为:马尾松、黑松、火炬松,较其割伤处理(CK1)升高幅度大小亦为马尾松>黑松>火炬松。接种4h后,3种松树针叶内双链核酸活性迅速上升,其上升趋势火炬松>马尾松>黑松,接种12h时火炬松针叶内双链核酸活性接近黑松;这说明接种松材线虫后4～12h,火炬松体内双链核酸酶活性上升速度比黑松快。接种24h后,火炬松针叶内双链核酸酶的变化幅度平缓,黑松和马尾松则迅速升高,48h时活性大小依次为:马尾松、黑松、火炬松,此时黑松较其CK1升高幅度接近马尾松,且明显高于火炬松。接种48h后,火炬松体内双链核酸酶活性迅速上升,黑松变化平缓,马尾松则迅速下降,在72h时马尾松体内双链核酸酶活性基本与黑松持平,且均高于火炬松,此时3种松树较割伤升高的幅度无显著差异。接种后96～120h,火炬松和马尾松针叶内双链核酸酶的活性迅速升高,而黑松则迅速下降(图3b,c)。3接种松材线虫后与松树生长的关系NO在植物中具有广泛的调节功能,特别是在植物-病原菌互作过程引发的与抗病相关的细胞死亡和基因表达中起关键作用。NO对植物体的作用具有双重性:一方面,可通过与有效分子反应而直接起作用或通过改变细胞氧化还原电位差而间接起作用,参与植物的生长发育和对环境适应的信号传导过程,是信号网络系统的关键物质(王淼等,2005)。一方面,高浓度NO与O在3种松树与松材线虫互作过程中,其体内NO含量在12h时黑松>马尾松>火炬松,且在24～48h时达到显著差异。此时松树体内松材线虫的数量多少依次为:黑松、马尾松、火炬松(何龙喜,2010)。吴小芹等(2008)研究发现普通黑松在接种松材线虫4h后其皮层就发现大量线虫,而在抗性黑松的皮层则很少线虫。有研究表明适量的NO可以抑制过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性,从而抑制膜脂的过氧化;而高浓度的NO可与O大量研究表明松树割伤后泌脂速度大小依次为火炬松、马尾松、黑松(束庆龙等,2006)。在本研究割伤只接无菌水的处理中,火炬松和马尾松针叶内NO在4h时较其健康状态的含量均有所升高,且火炬松升高幅度比马尾松大,而黑松基本与其健康状态值持平。可见抗性强的松树对割伤的反应更敏感,NO含量在割伤早期的迅速升高可能与其诱导早期的防御反应有关。这似乎可推测,在自然界中火炬松在天牛取食制造伤口时,可能由于其松脂分泌迅速,使得天牛体上携带的松材线虫不易进入松树体内,而黑松和马尾松则可能由于未能迅速分泌大量的松脂而易受到松材线虫的侵害。近年研究发现:核酸酶在植物细胞分化,寄主对病原菌的过敏性反应,寄主对环境胁迫的反应和叶片衰老等中具有重要的作用。在烟草过敏性反应中,核酸酶NUCⅠ、核酸酶Ⅱ和核酸酶Ⅲ被诱导,并且与烟草细胞死亡同步(Ryersonetal.,1996)。Wood等(1998)在大麦(Hordeumulgare)叶片衰老的研究中发现黑夜能诱导核酸酶活性升高,并导致叶片衰老,并指出不同的植物可能存在对核酸酶不同的调控机制。本研究表明黑松、马尾松和火炬松接种松材线虫后,其针叶内单链核酸酶活性在4～48h时为火炬松>马尾松>黑松,而双链核酸酶的活性在4～96h火炬松却一直低于马尾松和黑松,这表明不同松树体内