全国艾滋病检测技术规范(2009年版)解读

《全国艾滋病检测技术规范》（2009年版）解读与实验室规范化管理

邢爱华陕西省疾病预防控制中心陕西省艾滋病确证中心实验室2010年5月21日西安内容一、艾滋病病毒基本知识二、艾滋病检测技术规范一、艾滋病病毒基本知识名词解释HIV病原学HIV生物学性质艾滋病病毒与艾滋病英文名词HIV:humanimmunodeficiencyvirus，人类免疫缺陷病毒，即艾滋病病毒。AIDS:acquiredimmunodeficiencysyndrome，获得性免疫缺陷综合征，艾滋病是译音。

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起的一种慢性的病死率极高的严重传染病,它的医学全称为获得性免疫缺陷综合症。HIV侵入人体后，直接侵犯CD4+T淋巴细胞，破坏人体的免疫系统，使感染者逐渐丧失对各种疾病的抵抗能力，最后导致各种机会性感染和肿瘤。目前还没有疫苗可以预防，药物只能抑制病毒。

注意:艾滋病不要误写为“爱滋病”。什么是艾滋病？HIV病原学HIV属逆转录病毒科慢病毒亚科，属于卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》中的危害程度第二类病原微生物，为高致病性病原微生物。HIV分为HIV-1和HIV-2两型，全球85%以上的艾滋病是由HIV-1型引起。HIV-2主要集中在南非等地，在我国远洋船员、归国人员中发现HIV-2。

HIV-1基因具有高度变异性，其在传播过程中，产生很多亚型。目前流行的亚型有11个，为主要群体（M群：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J亚型）和次要群体（O群：O亚型）。各亚型间的核苷酸序列差异较大，A－H亚型间差异一般在22％－35％之间，而O亚型与A－H亚型之间差异高达50％以上。HIV-1亚型的鉴定和区分，主要是根据HIV-1env基因C2-V3区的不同序列来决定。HIV病毒电镜模式图HIV感染细胞过程

HIV-1囊膜糖蛋白gp120与靶细胞上的受体CD4结合gp120的构象发生改变继而与靶细胞上的辅受体CCR5结合导致gp41的构象改变暴露其融合肽并插入到宿主细胞膜病毒侵入宿主细胞1.2:HIV包膜糖蛋白(gp120)粘附到淋巴细胞表面CD4受体上，并趋化协同受体靠近gp1203.gp120粘附CD4,构象变化使gp120结合CD4分子附近的趋化因子协同受体CCR5.CXCR上4.5:gp120进一步构象变化使gp41的疏水端插入细胞膜,病毒和细胞膜接触融合,病毒内物质进入细胞艾滋病病毒感染机理艾滋病的致病机理不断破坏T4细胞降低免疫力MatureformsofHIVinatissuesample细胞崩解HIV生活周期吸附－穿入－脱壳－生物合成－组装成熟和释放HIV基因组HIV基因组由两条单股正链RNA组成。HIVRNA长约9.2～9.7kb，含3个结构基因（env、gag、pol），6个调节基因（tat、rev、nef、vif、vpu、vpr），5′端和3′端各含长末端序列。ENV：gp160、gp120、gp41GAG:P66、P51、P31POL：P55、P24、P17HIV基因组模式图ENVelope包膜抗体gp160-gp41四聚体比gp41单体浓度高常常被首先检测到的指标之一存在疾病的全部过程与HIV-2有交叉反应gp120–外膜蛋白+Trimerofgp41

浓度比gp160低与gp160检测到非常特异gp41–跨膜蛋白ENV印迹最不敏感存在疾病的全部过程和HIV-2没有交叉反应,但常常和HIV-1的O亚型有交叉GAG抗体(groupantigenspecific)

p24-Coreassociatedprotein衣壳蛋白常常首先被检测到特异性非常低抗体水平随病程进展降低p17-Matrixassociatedprotein内膜蛋白诊断价值低特异性低p55-Precursorp24+p17+LMW(9kd+5kd)POL抗体p66andp51

–逆转录酶p66比p51通常较多出现通常在发现ENV和GAG30-60天后能检测到p66p66与HIV-2很容易有交叉反应p66抗体水平随病程进展降低p51抗体诊断价值小p31

–内切酶

常常与p66同时检测到p31抗体水平随病程进展降低容易和GAG片段p32混淆

HIV对外界环境中理、化因素抵抗力远低于HBV,常用消毒剂均可使其失活。

0.5%次氯酸钠或70%酒精1min即可使HIV失活。HIV离体干燥环境下2至7min即可失活。HIV对热敏感，WHO推荐100℃20分钟灭活HIV。HIV生物学性质HIV感染自然史急性期无症状期持续性淋巴结肿大期临床期（艾滋病期）急性期症状50%以上的患者在感染后2周到2个月出现。传染性单核细胞增多症样表现：发热、皮疹、关节痛、头痛、咽痛、乏力、淋巴结肿大、出汗、恶心、呕吐、腹泻。发生率10-15%。通常在2-4周内自行缓解。无症状期无症状期一般2-10年最早6个月性传播时，平均8年HIV-2感染时较晚，最长可达20年一旦发病，通常在18个月内死亡潜伏期的长短与机体免疫状态和感染病毒的量有关艾滋病的临床表现机会性感染肿瘤艾滋病痴呆综合征消耗综合症机会感染 所谓机会感染就是说当人体的免疫功能下降时，原本已经寄生在人体中一些非致病菌可以造成的疾病，或者是对致病菌的易感性增加所造成的机会感染，而这种感染，对于一个具有正常免疫功能的人来说，不会造成疾病状态。 主要病原：病毒感染，卡氏肺孢子虫肺炎，分支杆菌感染，霉菌感染，细菌感染，弓形体病，隐孢子虫病。艾滋病检测实验室管理实验室（Laboratory）

实验室：也称试验室，是进行科学实验或试验的场所。根据学科领域的不同，实验室可分为生物实验室、化学实验室和物理学实验室。病原微生物实验室：指从事传染性物质操作活动的实验室，主要有研究用实验室、临床检验实验室、公共卫生实验室、传染病监测实验室等。艾滋病检测实验室

是指对人体血液、其他体液、组织器官、血液衍生物等进行艾滋病病毒、艾滋病病毒抗体及相关免疫指标检测的所有实验室的统称。艾滋病检测包括监测、检验检疫、自愿咨询检测、临床诊断、血液及血液制品筛查艾滋病检测实验室要素 人员要求 试剂要求样本要求技术要求环境要求 设备要求

实验室管理原则在不同等级的实验室，建立统一的实验室操作规程和生物安全要求标准根据不同的生物安全级别，实验室装备必要的实验与防护设备实验室实行严格的科学化管理目的：按照实验技术、科学规律，利用物理、化学、生物、辐射等各种方法，得到一个接近真值的一个近似值。

实验室规范化管理依据1、《国家实验室认可和计量认证》要求2、《实验室生物安全通用要求》GB19489-2004）3、《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》(WS233-2002),2002.4、《生物安全实验室建设技术规范》（GB50346-2004）

实验室规范化管理依据5、《医学实验室质量和能力的专用要求》6、《检测和校准实验室能力的通用要求》7、《全国艾滋病检测工作管理办法》（2006)8、《全国艾滋病检测技术规范》（2009)艾滋病检测工作管理历程1990.全国HIV检测管理规范（试行）1997.9.全国艾滋病检测工作规范2003.5.全国艾滋病检测技术规范（试行）“规范”2004.8全国艾滋病检测技术规范2006.6全国艾滋病检测工作管理办法--“办法”（卫生部）“全国艾滋病检测工作管理办法”

使AIDS检测工作列为法制管理，其意义是通过HIV检测实验室实行全面的准入制度（实验室准入、人员准入、试剂准入、设备准入）、分类分级网络化管理、检测工作质量管理、实验室生物安全和监督管理，真正确保实验室HIV检测的正确性，确保全国HIV检测工作管理的科学化、标准化、法制化，人身安全和环境保证。全国艾滋病检测技术规范版本2003年5月 试行2004年6月 修订2004年8月 正式版（卫生部疾病控制司2004年9月7日下发<卫疾控艾防便函(2004)95号>）2009年9月 修订本2009年12月 修订版目录（2004年版）第一章样品的采集和处理…………….…………1第二章HIV抗体检测………..……………………3

第三章HIV核酸定性检测………13第四章HIVRNA定量测定（病毒载量测定）..………………17第五章CD4+和CD8+T淋巴细胞检测…………22第六章HIV抗原检测……………26第七章艾滋病实验室安全防护和职业暴露预防………………29第八章艾滋病实验室质量管理…………………39第九章艾滋病实验室质量考评办法……………46第十章HIV诊断试剂临床质量评估方案………50目录（2004年版）附表1HIV抗体筛查报告……………53附表2HIV抗体复检化验单…………54附表3HIV抗体确认检测报告单....…55附表4HIV感染流行病学监测疫情报告单…………56附表5HIV抗体替代策略检测报告单…………..…57附表6HIV抗体检测数季报表………58附表7艾滋病职业暴露个案登记表…59附表8艾滋病防治工作人员职业暴露事故汇总表…62《2009版》修改、增补和完善内容（1）在样品的采集和处理中，增加了滤纸干血斑样品、快速检测样品的采集和处理，用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定样品、尿液和唾液样品的采集和处理；（2）在HIV抗体检测中，增加了免疫荧光法和化学发光法，进一步明确了不同情况下的检测策略；（3）在HIV核酸检测中，增加了HIV感染产妇所生婴儿HIV感染早期诊断检测流程和适用于窗口期的集合核酸检测方法；（4）根据临床治疗需求，增加了HIV-1的耐药检测；（5）进一步完善了艾滋病检测实验室安全防护和艾滋病检测实验室的质量管理，使其更加符合目前艾滋病防治工作的需求，更加具有可操作性；（6）考虑到技术发展和新的需求，增加了HIV-1新近感染检测和HIV-1的分离培养技术。《2009版》修改、增补和完善内容《全国艾滋病检测技术规范（2009修订版）》本《规范》自发布之日起实施，同时终止《全国艾滋病检测技术规范(2004年版)》本《规范》适用于全国所有的艾滋病检测实验室起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心目录（2009年修订版）第一章样品的采集和处理…………….…………1第二章HIV抗体检测………..……………………5

第三章HIV-1抗原检测……….………………19第四章HIV核酸检测………….………21第五章HIV-1耐药检测..………....………………31第六章CD4+和CD8+T淋巴细胞检测…………

35第七章HIV-1的分离培养………39第八章实验室安全安全…………41第九章艾滋病检测实验室质量管理……………50第九章艾滋病实验室质量考评办法……………46目录（2009年修订版）附表1HIV抗体筛查报告……………59附表2HIV抗体复检检测单…………60附表3HIV抗体确证检测报告单....…61附表4HIV抗体替代策略检测报告单……………….62附表5流行病学监测HIV抗体检测报告单…………63附表6艾滋病病毒抗体检测数及阳性人数统计报表…64附表7CD4+T淋巴细胞检测结果报告………………65附表8HIV-1耐药基因型检测报告………..…………66附表9艾滋病职业暴露个案登记表…68附表10艾滋病防治工作人员职业暴露事故汇总表…71第一章样品的采集和处理1范围

2规范性引用文件3样品种类及相应的用途4操作步骤4.1采样前准备4.2采集和处理样品4.3样品的保存4.4样品的运送4.5样品的接收第二章HIV抗体检测

1范围2规范性引用文件3HIV抗体检测实验室要求4HIV抗体检测的目的和要点4.1HIV抗体检测的目的4.2HIV抗体检测的要点5以诊断为目的的检测策略5.1常规HIV抗体检测的方法和程序5.2其它HIV抗体检测的方法和程序第二章HIV抗体检测6以监测为目的的检测策略6.1适用范围6.2检测程序及结果报告7以血液筛查为目的的检测策略8艾滋病检测实验室检测信息上报9质量控制9.1抗体检测的统计学室内质量控制9.2快速检测质控第三章HIV-1抗原检测1范围2规范性引用文件3HIV－1P24抗原检测的意义4实验室要求5检测方法及程序5.1试剂5.2样品5.3定性检测5.4定量检测5.5

结果报告和解释6质量保证和质量控制

第四章HIV核酸检测1范围2规范性引用文件3核酸检测的意义3.1早期诊断3.2疑难样本的辅助诊断3.3遗传变异监测3.4耐药性监测3.5病程监控及预测3.6指导抗病毒治疗及疗效判定4HIV核酸检测实验室要求4.1实验室分区和功能4.2实验室人员和要求4.3实验室设施和设备第四章HIV核酸检测4.4实验室生物安全4.5防止实验室核酸残余（Carry-over）污染措施4.6废弃物处理制度5HIV核酸检测方法及程序5.1HIV核酸定性检测5.2HIV核酸定量检测5.3集合核酸定性检测（PoolingPCR）5.4婴幼儿HIV感染核酸检测6质量保证和质量控制6.1实验室分区和环境6.2仪器设备质量控制6.3检测过程质量控制6.4外部质量控制

第六章CD4+和CD8+T淋巴细胞检测1范围2规范性引用文件3CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的意义4CD4+和CD8+T淋巴细胞检测实验室要求4.1人员4.2设施和设备4.3功能分区5常规CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的方法和程序5.1样品采集、运输和接收5.2方法5.3实验资料的记录5.4结果报告6质量控制第八章实验室生物安全1范围2规范性引用文件3HIV的生物危害4HIV相关检测的生物安全级别5生物安全保证措施6污染物处理7意外事故处理8职业暴露后预防第九章艾滋病检测实验室质量管理1范围2规范性引用文件3质量保证(8个方面)4质量控制5质量评价5.1内部质量评价5.2外部质量评价6诊断试剂临床质量评估一、筛查实验室人员要求至少由3名医技人员，其中1名中级卫生技术职称具有2年以上从事病毒性疾病血清学检测工作经验接受过省级以上艾滋病检测技术和生物安全培训获得培训证书。-----卫生部《全国艾滋病检测工作管理办法》实验室人员和要求进行HIV/AIDS患者CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的人员须具有上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全培训、检测技术、质量控制和仪器厂家提供的培训。进行核酸检测的人员须具有艾滋病检测实验室的上岗资格，……及厂家的培训。进行HIV-1耐药基因型检测的人员……须具有国家级实验操作技术培训合格证。二、HIV检测试剂要求经国家食品药品监督管理局（SFDA）注册批准有效期内的试剂中检所：批批检合格（酶联免疫试剂）CDC：临床评估质量优良采供血机构：必须使用HIV-1/2三、样品的采集和处理3样品种类及相应的用途3.1全血、血清、血浆、唾液、尿液以及DBS样品可用于HIV抗体检测。3.2抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定。3.3血浆可用于HIV-1病毒载量、基因型及耐药检测。DBS样品可用于HIV-1基因型及耐药检测。3.4全血、血浆、淋巴细胞富集液、外周血淋巴细胞（PBMC）及DBS样品可用于HIV核酸的定性检测。4.1.1样品的编码和记录4.1.2应制定样品编码的标准操作程序（SOP），规定样品编码的原则和方法，为样品制定唯一性编码（编号），保证其唯一性。4.1.3采血前，先对装有样品的离心管或滤纸进行标记，核对后编码。要将标签贴在试管的侧面，最好使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。4.1.4应使用专门的样品记录本或登记表记录样品，同时录入电脑保存。4.2采集和处理样品4.2.1血液4.2.1.1抗凝全血：消毒局部皮肤，用加有抗凝剂（EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠）的真空采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管中，轻轻颠倒混匀6～8次，备用。4.2.1.2末梢全血：4.2.1.3血浆：将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15min，上层即为血浆，吸出置于合适的容器中，备用。4.2.1.4血清：根据需要，用一次性注射器（或真空采血管）抽取5～10ml静脉血，室温下自然放置1～2h，待血液凝固、血块收缩后再用1500～3000r/min离心15min，吸出血清，置于合适的容器中，备用。复检样品的保存4.3.4艾滋病检测确证实验室收到的筛查阳性样品，无论确证结果如何，均应将剩余的样品保存至少10年，特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。四、检测方法的要求以诊断为目的的检测策略

常规HIV抗体检测的方法和程序：分为筛查试验（包括初筛和复检）和确证试验以监测为目的的检测策略确证流程确证流程

1、使用HIV-1/2混合型试剂进行检测，如呈阴性反应，报告HIV抗体阴性（－）；2、如呈阳性反应，则报告HIV-1抗体阳性（＋）；3、如果不是阴性反应，但又不满足阳性判断标准，则报告HIV抗体不确定（±）。结合流行病学资料，在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。五、环境要求---房屋与设备筛查实验室1、建筑条件：实验室或检测区域应分为清洁区，半污染区和污染区，应符合二级生物安全实验室（BSL-2）要求。

建筑条件是基础、安全意识是关键。掌握原则、灵活运用；发挥资源、联合检测；独立式的、混合式的(共用半污染区）、开放式的3、仪器设备：酶标读数仪、洗板机、加样器（仪）、普通冰箱、水浴箱（或温箱）、离心机、消毒与污物处理设备、实验室恒温设备、安全防护用品和生物安全柜。(标本保存和使用与安全)三、网络实验室管理-分级管理国家艾滋病参比实验室省级艾滋病确认中心实验室艾滋病确认实验室艾滋病筛查中心实验室艾滋病筛查实验室（艾滋病筛查检测点）陕西省实验室网络及其建设

陕西省确证中心实验室