土壤中酵母分离

酵母菌的培养与观察一、 实验目的学会选择酵母菌在土壤中采样点并合理取样；掌握PDA培养基的配制方法；学习分离纯化酵母菌的基本操作技术，掌握微生物培养方法以及接种技术。学会使用高压蒸汽灭菌锅、显微成像系统等实验仪器设备；培养并学习微生物实验的一般思维及方法；了解酵母菌的生长特性、种类；观察并对比土壤，水果及酒曲中酵母菌的形态及种类。二、 实验原理酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1〜5微米'5〜30微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌在自然界分布广泛，目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5—6,常见于含糖份较高的环境，如果园土，菜地图及果皮等职务表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养集中，酵母菌比霉菌生长的快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做可抑制细菌生长），然后再固体培养基上划线分离。三、 实验器材培养基配方PDA培养基：马铃薯（去皮）<?xml:namespaceprefix=st1ns=〃urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags〃/>100g，蔗糖与葡萄糖分别10g，水500g，琼脂10g.PDA乳酸液态培养基：马铃薯（去皮）40g，蔗糖与葡萄糖分别4g，水200g，乳酸1ml仪器及其它用品小铲，500mL三角锥形瓶，500mL及300mL烧杯，药勺，无菌培养皿，剩9mL无菌水试管8支，无菌玻璃珠，接种环，酒精灯，称量纸，高压蒸汽灭菌器，超净工作台，移液器，分析天平，恒温培养箱，微波炉显微成像系统。四、 培养基制作方法PDA培养基的制作把马铃薯去皮，切成小块状，称量100克，放进500mL的水中用电热炉加热，边用玻璃棒搅拌，以免糊底，煮沸至马铃薯成糊状便停止加热。再用双层纱布放在大烧杯上，左手握住，右手戴上手套把马铃薯慢慢倾倒在纱布上，倒完便把纱布与滤渣拿起来把剩余的汁压挤出来。再用水补充至500mL，加10克葡萄糖及10克琼脂，搅匀后用报纸折成小方块放在瓶口上用手沿瓶口形状往下按并用橡皮胶扎紧，放于高压蒸汽灭菌炉中，用121度灭菌15分钟。待其冷却至45度左右便在无菌条件下倒在灭菌了的培养皿上。待其冷却凝结后便倒置放进培养箱中备用。乳酸PDA培养液：制法同上，但不加琼脂而加1ml乳酸。土壤中酵母菌分离（下）五、 实验操作样品收集⑴土壤样本：在花圃里找开花较多的花丛下离地面5-10厘米的土壤取一小块土壤，⑵水果样本：一小块腐烂水果，一小块新鲜水果⑶酒样本：甜酒带酒糟的制作乳酸PDA培养液200ml，并分装到8支试管（4支25ml/支标记为A，4支24ml/支标记为B）培养纯化：⑴接种（：取适量样品直接加入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管A）中，分别标记为土、坏果、好果、酒，置30°C恒温培养箱，培养24h。⑵富集（09.5.8）:用无菌吸管去上述培养后培养液1ml,注入另一管（B）乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，作好标记，置30C恒温培养箱再培养24ho（第二天）⑶培养（09.5.9）:稀释样本：用1ml无菌吸管分别吸取1ml样品液^）注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，制成10-1、10-2稀释度的样品溶液。制作PDA培养基500ml，并分装28个，每项样品7个培养基，标记B管样品液为1，各稀释度分别为10-1、10-2各稀释度标记两个培养基（①②），共用24个，如：土10-1①，土10-1②；剩下4个培养基分别标记为土、坏果、好果、酒。取样培养：i.用干净的棉千取各稀释度液（包括B管样品），直接划线于对应稀释度的平板（标记为①的平板）用1ml移液器分别由各稀释液（包括B管样品）中吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板（标记为②的平板）中，各加入几个已灭菌的玻璃珠，轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠取出。用同上方法取A管中样品液（接种液，已培养两天）分别涂布于标记为土、坏果、好果、酒的培养基中。将所有平板（共28个）倒置于30C恒温培养箱中培养3日。观察（09.5.12）⑴观察菌落的形态，颜色。⑵在干净的载玻片上滴加一小滴无菌水，用灼烧过的接种环挑取菌种涂匀在载玻片上，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。六、 实验结果土壤样品：形成白色放射状菌落，较干燥，像发霉，易挑起，有明显中心，中心较边缘厚，可看到丝状。直径2cm左右。菌体形态见图1.1。★Cryptococcus属：为球状或卵形之细胞，无伪菌丝，细胞具粘性荚膜，无发酵能力，能形成starch-like物质。C.neoformans可感染人畜Cryptococcus症的病原菌。水果样品⑴腐烂水果：形成白色小菌落，表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色。直径约为1mm。（菌体见图2.1）⑵未腐烂水果：①B管中样品液形成白色小菌落，表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，在稀释度为1的样品中形成2个红色小菌落。直径约为1mm。（菌体见图2.2）②A管中样品形成大量粉红色小菌落，表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，直径约为1mm。（菌体见图2.3）★Kloeckera属：只会发酵glucose，常见于果实及果汁中，柠檬形两极出芽细胞，代表种为K.apiculata。★Hanseniaspora属：柠檬形两极出芽，为果实上之野生酵母，在葡萄酒酿造初期会出现，不久即被淘汰。代表种为H.valbyensis。★Rhodotorula属：会产生carotenoid色素，故称红色酵母，无发酵能力，但会污染食品。代表种为R.glutinis，干燥菌体内脂肪量可达60%以上，与Lipomyces属同为具有油脂生产能力之潜力菌种。会产生carotenoid红色色素的酵母还有Sporobolomyces属（具ballistospore）及Rhodosporidium属（会形成teliospore）。3、酒样品⑴形成菌落少，仅在稀释度为1的样品中形成菌落，两个白色小菌落，直径约3mm，菌落比水果的大，表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一（菌体见图3.1）；⑵在稀释度为10-1样品培养基中形成一个不规则，近圆形的大菌落，直径约2cm，表面光滑、湿润、粘稠，易挑起，但中心部位颜色明显较深，质地较厚，但分布不均，为芽胞杆菌菌落，可能是操作不当的污染，或者是酒液中其他微生物。（菌体见图3.2）★Saccharomyces属：酒精发酵能力很强，为酵母中最重要的属，是传统以来各类酒、制造酒精、制造面包等所使用的。细胞有球形、卵形或椭圆形，多极出芽。代表种有：S. cerevisiae=S.sake=S.ellipsoideus=S.cerevisiaevar.ellipsoideus=S.formosensis?（or=S.cerevisiaevar.formosensis?早期台研396酿酒精菌种）为制造啤酒、葡萄酒、清酒、酒精、面包等最常使用之菌种。S.carlsbergensis=S.uvarum从Carlberg的啤酒酿造场所分离之下面酵母（bottomyeast）。S.bayanus=S.pastorianus为不良酵母，造成啤酒发酵过程中有臭气产生，严重影响啤酒质量（有害菌）。S.diastaticus会分解dextrin&starch，不利于啤酒发酵，为啤酒制造过程中之有害菌。七、实验总结这次是我们首次自行设计实验，并实施。方案一几经制定才终于定下来，而且由于技术有限，同时既怕方案设计太简单，又怕太麻烦，对于实验内容也斟酌了几番，最终在匆匆忙忙中，终于定下了这个方案。但由于第一次制定方案，很多方面欠缺考虑，以及对微生物的不甚了解，设计的方案仍有许多欠缺。例如，在上述实验结果中，未腐烂水果A管样品中培养出大量红色酵母菌落，而B管各稀释液中仅稀释度为1的样品培养出2个红色酵母菌菌落，可以提出这样一个疑问：是否接种液培养48h后，其中微生物种类有所变化？是否某些微生物被淘汰？因此，对于A管的样品，也应该进行稀释涂布，并与B管样品对比。而对于划线法和涂布法的对比，个人认为纯属多余，实验时应该用这部分的培养基（编号为①的平板）进行A管样品各稀度的涂布。在实验过程中，由于操作的不熟悉，培养的那几天都弄到很晚，大家在操作上都有些不耐烦，于是在操作上不免有些马虎，使得出现被污染的可能。次外，在观察上，对于微生物不了解，有时很难判断，是微生物还是