第09章 酶免疫试验

临床免疫学检验技术第九章酶免疫试验王宏志目录第一节酶免疫试验的组成要素第二节酶免疫试验的分类第三节酶联免疫吸附试验第四节酶联免疫斑点试验第五节发光酶免疫试验第六节EIA临床应用及常用商品试剂的方法特点第七节影响酶免疫试验的主要因素第一节酶免疫试验的组成要素重点提示固相载体包被抗原或抗体酶结合物酶的显色底物与酶促发光底物一、固相载体微孔板：一般均使用聚苯乙烯塑料。磁微粒：结合容量大，分离步骤简单迅速。膜载体：包括NC膜、PVDF膜等，吸附能力较强。ELISA板二、包被抗原或抗体直接包被：直接吸附于固相载体表面ELISA：用碳酸盐溶液稀释包被抗体或抗原，加到微孔板中4℃过夜或者37℃2小时，常用牛血清白蛋白或小牛血清进行封闭。ELISPOT：用磷酸盐缓冲液稀释包被抗体，加到底部覆以PVDF膜等的微孔板中4℃过夜，常用脱脂乳封闭。包被抗原或抗体间接包被：间接吸附于固相载体表面亲合素-生物素化抗体（抗原）模式葡萄球菌蛋白A（SPA）-抗体模式三、酶结合物既参与高度特异的免疫反应，又起到生物催化放大作用。酶免疫试验测定的结果就是通过酶与显色底物或发光底物的相互作用来最终指示的。常用标记酶有辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。四、酶的显色底物与酶促发光底物酶的显色底物：HRP是酶免疫试验中常用的示踪系统，四甲基联苯胺（TMB）是ELISA最常用的显色底物。AEC和BCIP/NBT可产生不溶性色素。酶促发光底物：主要标记酶有HRP和ALP，可催化相应底物发光。常用发光底物为鲁米诺及其衍生物、AMPPD和4-MUP。第二节酶免疫试验的分类重点提示均相酶免疫试验异相酶免疫试验酶免疫试验的分类一、均相酶免疫试验（一）酶放大免疫试验技术一、均相酶免疫试验（二）克隆酶供体免疫试验二、异相酶免疫试验异相EIA在抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方法将游离酶标记物和结合酶标记物分离，其中固相酶免疫试验最为常用。固相酶免疫试验特点是将抗原或抗体制成固相制剂，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤，就可直接将抗原抗体复合物与其他成分分离。包括ELISA、ELISPOT、发光酶免疫试验等。第三节酶联免疫吸附试验重点提示基本原理ELISA方法建立的基本步骤方法类型及反应原理一、ELISA的基本原理将待测标本和酶标记抗体或抗原加入反应体系中，形成固相化的抗原抗体-酶复合物；用洗涤的方法将固相抗原抗体-酶复合物与其他成分分离；加入酶反应底物，生成有色产物，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。二、ELISA方法建立的基本步骤待测物选择免疫原的设计与合成抗体的制备ELISA方法类型的建立对建立方法进行评价三、ELISA的方法类型及反应原理ELISA既可用于测定抗原，又可用于测定抗体。有夹心法、间接法、竞争法和捕获法四种基本类型。三、ELISA的方法类型及反应原理（一）夹心法双抗体夹心法

三、ELISA的方法类型及反应原理双位点一步法三、ELISA的方法类型及反应原理双抗原夹心法三、ELISA的方法类型及反应原理（二）间接法三、ELISA的方法类型及反应原理（三）竞争法测抗原

三、ELISA的方法类型及反应原理竞争法测抗体三、ELISA的方法类型及反应原理竞争法（加中和抗原）检测抗体三、ELISA的方法类型及反应原理竞争法（间接包被抗原）检测抗体三、ELISA的方法类型及反应原理（四）捕获法第四节酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验ELISPOT是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞的检测技术结合了细胞培养技术和ELISA技术。主要用于细胞因子分泌细胞的定量测定。一、基本原理即用抗体捕获培养细胞所分泌的细胞因子，并以酶联免疫斑点显色方式将其表现出来。二、数据处理及结果报告ELISPOT检测的最终数据是细胞频率，即在细胞群体中，受某种特异性抗原刺激而分泌某种细胞因子的阳性细胞比例。斑点形成细胞（SFC）数目可在显微镜下或采用酶联斑点分析仪自动化进行。第五节发光酶免疫试验LEIALEIA反应原理与ELISA相似，主要不同在于LEIA中酶作用的底物为发光底物。常用标记酶为HRP和ALP根据酶促发光底物的不同，可分为化学发光酶免疫试验（CLEIA）和荧光酶免疫试验（FEIA）。一、基本原理用参与催化某一发光反应的酶来标记抗体（或抗原）。在抗原抗体反应后加入发光底物。酶催化和分解底物发光。由光检测仪检测发光强度，最后通过标准曲线计算出被测物的含量。。二、化学发光酶免疫试验HRP标记的酶促发光反应