污水厂养殖池中好氧反硝化微生物的分离、鉴定及功能筛选

污水厂养殖池中好氧反硝化微生物的分离、鉴定及功能筛选

0污水反硝化技术亚硝酸盐是影响水产养殖废水和生活废水的主要有毒物质。较高浓度的亚硝酸盐对动物和人均有致死作用,即使在安全浓度范围内也会对动物体和人体的抗病力及生理功能产生不良影响。水体中,氮以-3至+5九种不同价态形式存在,在生物及非生物因素的共同作用下,各种价态形式的氮在水体内不断迁移转化,形成一个复杂的动态循环目前污水反硝化处理技术包括物理法、化学法及生物反硝化法。其中,物理、化学法操作复杂,需要增加设备投资额,运行成本高。同时该方法对有机物去除效率低,会造成二次污染,因此在实际运用中存在一定的局限性。近年来,人们开始尝试利用微生物、植物或其他生物自身具有的功能消除或改变污染物存在形态,达到降低污染物毒性的目的1材料和方法1.1反硝化微生物2013年8~9月分别从厦门筼簹污水处理厂和前埔污水处理厂初沉池、避风坞海水排污口、海洋三所污水池、漳浦对虾养殖池采集污水和污泥样品进行反硝化微生物的富集。1.2培养基的制备富集培养基:葡萄糖5g,乙酸钠1g,柠檬酸钠2.5g,NaCl30g,KH分离培养基:以MarineAgar(MA)和216LB固体培养基(硝酸铵0.2g,乙酸钠1g,柠檬酸钠0.5g,蛋白胨10g,酵母粉2g,NaCl30g,琼脂粉15g,加超纯水至1L,调pH7.5,121℃高压蒸汽灭菌20min)作为分离培养基。1.3菌株纯化及验证富集驯化:取10g污泥/污水样品接种于150mL液体富集培养基中,在28℃、转速为160r·min菌种分离、纯化:富集培养后,取一定量富集培养液采用梯度稀释平板划线法,在MA或216LB固体培养基上涂板分离纯化单菌。纯化完全后保种并进行反硝化效果验证。每个菌株的编号前面均由两个字母组成,以硝酸盐为唯一氮源分离的菌株编号以X开头,以亚硝酸盐为唯一氮源分离的菌株编号为Y开头。第二个字母代表分离生境,Y、Q、D、P、T1、T2及T3分别代表分离自筼筜污水处理厂、前埔污水处理厂、海洋三所污水池、避风坞排污口和漳浦对虾养殖场的1号、2号及3号养殖池。1.4srrna基因扩增16SrRNA基因测序及系统发育分析:用TIANGEN试剂盒提取单菌基因组DNA,进行16SrRNA基因扩增。16SrRNA基因扩增正向引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(位于E.coli16SrRNA基因的第8~27个碱基位置);反向引物:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′(位于E.coli16SrRNA基因的第1512~1493个碱基位置)1.5单带反硝化效果的验证对分离纯化的单菌进行反硝化功能初筛,初筛培养基成分和富集培养基相同,培养基初始的NO复筛培养基初始的NO检测分析方法:NO2结果与分析2.1不同生境来源样品中的单菌以NaNO5个不同生境来源的样品微生物组成差异较大,其中,从前埔污水处理厂样品富集分离获得20株单菌,包括盐单胞菌属(7/20)、棒状杆菌属(Corynebacterium,2/20)、芽胞杆菌属(2/20)、海杆菌属(2/20)、海源菌属(1/20)、放线菌属(Aeromicrobium,1/20)、别样海源菌属(1/20)、短杆菌属(Brevibacterium,1/20)、迪茨菌属(Dietzia,1/20)(1/20)、副球菌属(Paracoccus,1/20)和海洋杆菌属(Pelagibacterium,1/20);筼筜污水处理厂样品分离获得18株单菌,包括盐单胞菌属(7/18)、微杆菌属(Microbacterium,2/18)、棒状杆菌属(1/18)、海杆菌属(1/18)、海源菌属(1/18)、别样海源菌属(1/18)、迪茨菌属(1/18)、假单胞菌属(1/18)、嗜冷菌(Psychrobacter,1/18)、Rehaibacterium(1/18)和斯塔普氏菌属(Stappia,1/18);漳浦对虾养殖场的3口养殖池共分离获得64株单菌,主要包括盐单胞菌属(12/64)、芽胞杆菌属(10/64)、假单胞菌属(7/64),其次为海源菌属(4/64)、副球菌属(3/64)、节杆菌属(Arthrobactor,3/64)、微杆菌属(2/64)、Alishewanella(2/64)、红细菌属(Rhodobacter,2/64)、放线菌属(1/64)、壤霉菌属(Agromyces,1/64)(1/64)、别样海源菌(1/64)、Belliella(1/64)、Brachybacterium(1/64)、德沃斯氏菌(Devosia,1/64)(1/64)、Fontibacter(1/64)、喜盐芽胞杆菌(Halobacillus,1/64)、咸海鲜芽胞杆菌(Jeotgalibacillus,1/64)、溶杆菌(Lysobacter,1/64)、海杆菌(1/64)、中间根瘤菌(Mesorhizobium,1/64)、大洋单胞菌(Oceanimonas,1/64)、海洋杆菌(1/64)、发光细菌(Photobacterium,1/64)、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium,1/64)、斯塔普氏菌(1/64)、弧菌(Vibrio,1/64)和卓贝尔菌(Zobellella,1/64);避风坞排污口样品分离获得14株单菌,包括盐单胞菌(7/14)、别样海源菌(2/14)、芽胞杆菌(1/20)、海杆菌(1/20)、Arenibacter(1/20)、圆杆菌(Cyclobacterium,1/20)、维诺格拉斯基氏菌(Winogradskyella,1/20);污水池样品中富集分离获得12株单菌,包括盐单胞菌(6/12)、芽胞杆菌(3/12)、海源菌(2/12)和海杆菌(1/12)。尽管不同生境来源样品富集分离的单菌存在较大差异,但有些种属广泛存在于各个不同生境中。其中γ-变形菌纲的盐单胞菌属占绝对优势,广泛存在于所有生境来源的样品中,且均为各个富集样品中的优势菌。本研究中共富集分离获得40株盐单胞菌,占总菌数的29.7%。40株单菌的16SrRNA基因与模式菌序列相似性在97.4%~99.7%,分布在15个不同的种,多样性很丰富,主要包括大庆盐单胞(Halomonasdaqingensis)、Halomonasalkaliantarctica、坎帕尼亚盐单胞菌(Halomonascampaniensis)、热水管盐单胞菌(Halomonashydrothermalis)、Halomonasjohnsonia、Halomonasmongoliensis等菌株。芽胞杆菌属是仅次于盐单胞菌属的优势菌。除了筼筜污水处理厂采集的样品中没分离到以外,其他样品中均有分离获得。通过形态筛选、测序分析及剔除重复共获得16株不同样品来源的单菌。这些单菌分布在12个种,多样性丰富,与模式种的16SrRNA基因相似性在97.5%~100%之间。此外,本研究共分离获得8株假单胞菌,分属于7个种,其中在对虾养殖池的三个样品中共分离获得了7株假单胞菌,分布在6个种。海源菌属在本研究中也属于较为优势的菌属之一,共分离获得8株菌,分属于5个种,该属广泛分布于养殖场、污水处理厂、污水池等生境中。同时本研究还分离获得6株海杆菌属的单菌,与模式种16SrRNA基因相似性在97.19%~99.85%之间。其中在污水处理厂样品中分离获得5株,在养殖池中仅获得1株。别样海源菌为本研究中另一分布较广的菌属,从排污口、污水处理厂、养殖池共分离获得5株菌。上述各个菌属在本研究采集的样品中分布较广。此外,从每个污水样品中亦分离获得一些独有菌株,如棒状杆菌和迪茨菌,在本研究中仅在两个污水处理厂的样品中分离获得,分别获得3株和2株。从养殖池的三个样品中各分离获得1株烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae),而在污水处理厂的样品中未分离得到节杆菌。16SrRNA基因序列分析还表明,128株单菌中至少有24株潜在的新种,其中菌株XPN-3、XT1S-3、XY1-1、XT2-4与最近源模式种相似性低于95%,为潜在的新属。XQ2-2-1、YQ2-4、YT1S-1a及YQ2-1-1A的16SrRNA序列与相应模式菌相似性低于97%,另有16株菌的16SrRNA序列与相应模式菌相似性在97%~98%,均为潜在的新种2.2主要微生物及微生物指标以20mg·L16SrRNA序列分析结果表明,21株反硝化效果好的单菌与模式菌相似性为97.84%~100%,分属于γ-变形菌纲、放线菌纲及α-变形菌纲等3个纲的6个属,其中15株为盐单胞菌属,以大庆盐单胞菌为主,其次为坎帕尼亚盐单胞菌、嗜碱盐单胞菌(H.alkaliphila)、玻利维亚盐单胞菌(H.boliviensis)、H.salifodinae及H.johnsoniae。另外5株为:印度洋斯塔普氏菌(Stappiaindica)、烟草节杆菌、脱氮卓贝尔氏菌、Devosiachinhatensis及强酒海杆菌(Marinobactervinifirmus)。其中节杆菌、卓贝尔氏菌及海杆菌等属作为好氧反硝化菌鲜有报道,而斯塔普氏菌属细菌为首次报道具有好氧反硝化功能。卓贝尔氏菌YT1-8能在24h内将100mg·L3单一氮源及微生物多样性为了解不同环境样品中好氧反硝化微生物的多样性,并分离获得这些微生物资源,本研究采集了污水处理厂、排污口、污水池、对虾养殖池等不同生境来源的污水污泥样品,进行反硝化微生物的富集,获得了128株可培养单菌。这128株单菌主要分布于6个纲38个属,其中以γ-变形菌纲纲的盐单胞菌、海源菌、海源菌和微杆菌,芽胞杆菌纲的芽胞杆菌属为主。128株菌中有35株菌具有反硝化功能,反硝化效果较好的菌株主要为γ-变形菌纲的盐单胞菌属和卓贝尔氏菌属。本研究有助于了解不同环境中反硝化微生物的分布和多样性,同时为含氮废水的生物修复提供菌种资源。氮源是生物生长繁殖所必需的营养物质之一。本研究分别以硝酸盐和亚硝酸盐为唯一氮源对污水处理厂、污水池、排污口及对虾养殖池等5个不同生境来源的样品进行富集分离。不同生境对分离结果影响较大的样品获得的微生物组成差异较大,污水处理厂、对虾养殖池的可培养微生物种属较排污口和污水池丰富,获得的可培养单菌数目较多。其中获得种属多样性最丰富的样品为对虾养殖池3,共获得27株单菌,分布在23个种;东区污水池样品富集分离获得的单菌数量少且种属较单一,共获得12株单菌,分布在4个属的10个种。盐单胞菌在本研究所涉及的所有样品中均分离获得;芽胞杆菌除了未在筼筜湖污水处理厂样品中分离获得外,在其他样品中均广泛存在;节杆菌和假单胞菌主要在养殖场分离获得。此外,氮源的种类对富集结果也有一定影响。以硝酸盐或亚硝酸盐为唯一氮源富集分离的单菌各获得22和21个属的细菌,两者分离结果多样性相似。但各自也存在一些独立菌株,如:放线菌、壤霉菌、Alishewanella、短杆菌、Cyclobacterium、德沃斯氏菌、迪茨菌、溶杆菌、海洋杆菌、发光杆菌、Rehaibacterium、鞘脂杆菌、斯塔普氏菌及弧菌等菌属只在以硝酸盐为唯一氮源时获得,而别样海源菌属、不动杆菌、Brachybacterium、棒状杆菌、Fontibacter、Jeotgalibacillus、海单胞菌、副球菌、嗜冷菌、Winogradskyella及卓贝尔氏菌等菌属仅在以亚硝酸盐为唯一氮源时分离得到,表明氮源对反硝化微生物的种类具有一定的选择性。微生物在氮循环中发挥着极为重要的作用。目前对土