广州地区产imp-9金属酶铜绿假单胞菌的同源性分析

广州地区产imp-9金属酶铜绿假单胞菌的同源性分析

铜绿假单胞菌是医院感染的重要病原体。它可以在医院环境中长期存在。特别是如果身体阻力降低或免疫功能受损，相关的医院感染可能会持续。由于存在多种耐药机制,临床表现为多重耐药性。2005~2007年广州地区多家医院曾出现产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的爆发流行有该流行株的存在,我们收集了2007年10月到2008年11月广州地区7家医院出现的对所有常见抗菌药物耐药的铜绿假单胞菌泛耐株(PDR)共269株,从中筛选出产IMP-9金属酶的菌株,并以2005年爆发克隆株作参考,了解产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的分子同源性。1材料和方法1.1菌株鉴定及鉴定菌株收集2007年10月至2008年11月广州地区7家大型医院所保留的铜绿假单胞菌多重耐药株共269株。阳性对照株为2005年出现爆发流行的产IMP-9克隆株2376。铜绿假单胞菌ATCC27853为阴性对照株。菌种鉴定采用VITEK2系统(Biomerieux,法国)。主要仪器和试剂LambdaLadderPFGMarker购自美国NEB公司、PCR引物和序列分析均由上海英俊生物技术有限公司合成和检测、梯度PCR仪购自德国Eppendorf公司、GEL-DOCXR凝胶成像系统购自美国BioRad公司。1.2制备菌体模板DNA的抽提(1)取大约0.2ml培养物加入离心管中,6000r/min离心2min沉淀菌体;(2)尽量将所有上清吸去,加入200µl的无菌水,混匀菌体;(3)100℃煮沸10min,置4℃10min,8000r/min离心10min,弃沉淀,上清液为模板。采用PCR方法筛查目标菌株的blaPCR产物测序PCR产物经纯化后送上海英俊生物技术有限公司进行测序,测序结果采用GeneBank中的BLAST程序进行对比分析。ERIC-PCR分子流行病学分型患者临床资料分析回顾性分析了10例携带IMP-9金属酶铜绿假单胞菌患者的病例资料,了解其基本情况、诊疗经过、细菌学检查等。2结果2.1imp阳性对照株的鉴定菌株985,3798,1401,1245,1380,447,2949,4530,4555,3768和IMP-9阳性对照株2376在约490bp处出现相同的条带(见图1),通过对985,3798号菌株的IMP-9基因PCR阳性产物进行正向测序,经ClustalW程序分析,其核酸序列与GenBank已登陆的bla2.2不同基因型的a、b、c型的分子身份证菌株1245,1380,1401,3798为A1型,985为A2,3768,4555,4530为A3,447为A4型,2949为A5型,均为A克隆,为同一基因型,阳性对照株2376为B型,A,B型之间的相似度低于80%,故分属不同克隆(图2)。2.3机械通气和纤支镜检查10株IMP-9金属酶铜绿假单胞菌均来自同一家医院A医院的痰标本,其中来自于ICU病房4株,呼吸内科普通病房4株,胸外科2株,其中来自ICU的患者均为有接受机械通气和纤支镜检查的病史,其余6位都曾接受过纤支镜检查。编号447,2949,3768,3798共4位患者在2005年至2007年初即广州地区多家医院出现产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的爆发流行期,曾分别入住过A院呼吸内科,住院时间均在3个月以上,在上述住院期间均接受过机械通气或纤支镜检查,并且在痰标本中曾经分离出铜绿假单胞菌。所有10位患者都存在1种或1种以上严重的基础疾病:重症肺炎、慢性阻塞性肺气肿、肿瘤化疗或放疗后和肺移植术后等(表1)。3携带imp-9克隆株的临床分型2005年3月至2007年3月期间,我们曾对广州地区4家大型医院进行铜绿假单胞菌泛耐株的同源性检测,结果发现产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌克隆株的爆发流行,并且该克隆株主要集中在A医院从本次调查的结果发现,IMP-9克隆株仍然存在,且仍然集中于A医院,但与前期发现的爆发流行阳性对照株2376分属不同克隆。本次发现的携带IMP-9克隆株的10位患者,有4位曾在2005年3月至2007年3月,即IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的爆发流行期间入住过A医院,住院时间从3个月到半年不等,而其余6位患者均在2007年11月后首次入住A院。所有10位患者,住院期间均接受过至少一次机械通气或纤支镜等的侵入性器械检查。4位曾入院患者在IMP-9克隆株爆发流行期间也曾分离出泛耐的铜绿假单胞菌,且其耐药表型和本次分离株基本相同,对碳青霉烯类,第三代头孢菌素类,氨基糖苷类,喹诺酮类均耐药,但由于菌株的遗失,导致无法纳入本次分析,所以