重症监护室耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌相关耐药基因的研究

重症监护室耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌相关耐药基因的研究

铜绿假单胞菌是一种非发酵葡萄糖的革兰阴性菌，属于条件菌。近年来,随着广谱抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂等的应用以及介入性医疗操作的广泛开展,铜绿假单胞菌已成为医院感染和机会感染的主要病原菌。由于碳青霉烯类药物被临床广泛应用,铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物产生了耐药性,且对其耐药率也逐年上升。因此加强对碳青霉烯类药物耐药菌株的研究为临床有效控制其感染提供科学依据显得非常重要。1材料和方法1.1菌株的耐药从本院重症监护室临床感染标本中分离获得的44株对亚胺培南和美罗培南同时耐药铜绿假单胞菌(各种标本非重复菌株)。标准菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853,购自卫生部临床检验中心。1.2药敏试验鉴定所有菌株均由VITEK-60自动化分析系统鉴定确认,药敏采用K-B纸片扩散法测定铜绿假单胞菌对抗菌药物的敏感性,并根据CLSI要求进行抗菌药物敏感性判断。1.3材料和仪器全自动细菌鉴定仪VITEK-60购自法国生物梅里埃公司,PCR扩增仪购自美国PE公司。电泳仪为美国Bio-Rad产品。法国生物梅里埃公司生产的VITEK-GNI(鉴定板)和MH琼脂,K-B药敏纸片购自英国Oxoid公司,检测DNA试剂和试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。1.4统计方法用Whonet5.4软件进行统计学分析。1.5dna模板液制备采用煮沸法。挑纯菌落至PE管内(内置0.15mL灭菌蒸馏水),煮沸10min后立即放冷水上冷却,4℃10000r/min离心5min,无菌取上清液即为DNA模板液,-20℃保存备用。1.6pcr扩增条件PCR引物设计为MP基因P1:5′CGGCCGCAGGAGAG-GCTTT3′,P2:5′AACCAGTTTTGCCTTTACCAT3′,产物长度587bp;GM基因P1:5′CTTGTAGCGTTGCCAGCTTTA3,P2:5′CAGCCCAAGAGCTAATTGAGG3′,产物长度562bp;SPM基因P1:5′CTGCTTGGATTCATGGGCGCG3′,P2:5′CCTTTTC-CCGACCTTGCTCG3′,产物长度784bp;VM基因P1:5′ATTCCGGTCGGAGAGGTCCG3′,P2:5′GAGCAAGTCTAGACCGCCCG3′,产物长度633bp;IMI基因P1:5′CCATTCAC-CCATCACAAC3′,P2:5′CTACCGCATAATCATTTGC3′,产物长度400bp;oprD2基因P1:5′GCGCATCTCCAAGACCATG3′,P2:5′GCCACGCGATTTGACGGAG3′,产物长度193bp。PCR反应体系一致:PCR反应体系总体积为50ul。其中引物1μL,dNTP(200μmol/μL)1μL,10×缓冲液5μL,DNA模板2μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,双蒸水40.5μL。PCR扩增条件为:94℃初变性5min,然后94℃变性1min,56℃退火30s,72℃延伸60s,共循环35周期,最后一个72℃延伸5min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,用溴苯乙锭染色,并用凝胶成像系统观察摄像保存。2结果2.1采样区的来源分布见表1。2.2对左旋氧氟沙星和芽孢噻耐药率的影响对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、庆大霉素、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶和头孢吡肟耐药率分别为13.6%、50.0%、31.8%、25.0%、40.9%和50.0%;对左旋氧氟沙星和头孢噻肟耐药率接近90%;亚胺培南、美洛培南、氨苄西林、头孢唑啉、头孢西丁的耐药率均为100%;多黏菌素敏感率100%。见表2。2.3耐药基因检测44株PAE中检测到IMP阳性6株,阳性率13.6%,耐药基因VIM3株,阳性率6.8%,OprD2基因缺失21株,缺失率47.73%,其余耐药基因GIM、SPM和IMI未检出。3碳青霉烯酶及耐药基因的检测亚胺培南及美洛培南是碳青霉烯类抗生素代表药物,其抗菌谱极广,抗菌活性强,对包括超广谱β内酰胺酶和头孢菌素酶在内的多数β-内酰胺酶稳定,与第三代头孢菌素无交叉耐药性,被认为是临床上治疗具有多重耐药性的铜绿假单胞菌感染的重要抗菌药物碳青霉烯酶是能够明显水解碳青霉烯类抗菌药物的一类β内酰胺酶,它包括Ambler分子分类中的A、B、D类3类酶,其中B类为金属酶,属Bush分类中的3组,是铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类药物的主要β内酰胺酶,可由染色体、质粒或转座子介导。目前发现细菌的金属β内酰胺酶有5种基因型:IMP、VIM、GIM、SPM和IMI5种,其中最主要的IMP和VIM已