消渴中药胶囊对dbdb小鼠早期糖尿病视网膜病的治疗作用

消渴中药胶囊对dbdb小鼠早期糖尿病视网膜病的治疗作用

截至2017年底，中国约有14000名糖尿病患者，世界上约有第四.25亿人患糖尿病。预计糖尿病患者的数量将比2045年增加到69亿。渴络欣胶囊(KLX)作为国内临床用于糖尿病肾病(微血管病变)治疗的复方中药制剂药物、试剂与仪器渴络欣胶囊(批号170301,成都康弘制药有限公司),羟苯磺酸钙(批号1612133-1,西安利君制药有限责任公司),氯化钠注射液(批号E17030305,山东华鲁制药有限公司),一次性使用无菌溶药注射器(1mL,批号20160458,江苏治宇医疗器材有限公司),卡波姆滴眼液(批号1946,山东博士伦福瑞达制药有限公司),复方托吡卡胺滴眼液(批号170102,沈阳兴齐眼药股份有限公司),荧光素钠注射液(批号277608F,爱尔康眼科公司),戊巴比妥钠(批号57-33-0,德国Merck),速眠新注射液(批号20161208,吉林省康达动物药业有限责任公司),无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司),多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司),PBS(批号ZLI-9061,无锡傲锐东源生物科技有限公司),TritonX-100(批号MKB8708V,美国Sigma公司),BSA(批号SLBJ7347V,美国Sigma公司),H100只6～8周龄雄性自发性糖尿病小鼠模型C57BL/KsJdb视觉电生理仪(OPTO-Ⅲ),眼科超显微成像系统ISOCT(Optoprobe,加拿大);视网膜成像系统OPTO-RIS(OptoproberesearchLTD,加拿大);扫描成像数据中心(OptoprobeDN-17,加拿大);罗氏血糖仪活力型(06656919032,瑞士);血糖试纸(07124287),电子天平(YP1001N)(上海菁海仪器有限公司);湿盒(上海协力塑料制品厂);微波炉(美的集团);石蜡切片机(RM2245,Leica,德国);荧光显微镜(DP72型),正置显微镜(Olympus,日本);展片机(ZPJ-1A),烤片机(KPJ-1A)(天津天利航空机电有限公司)。方法模型小鼠随机分组20只同窝野生型小鼠作为①对照组;100只db/db小鼠随机分组为:②模型组,③～⑤渴络欣胶囊低、中、高剂量组(780,1560,3120mg·kg小鼠光学相干断层扫描电泳应用4D组织结构与功能评价系统(Optoprobe,加拿大)进行小鼠光学相干断层扫描。根据体质量,腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.003mL·g显微镜下荧光血管成像对大鼠血管和微血管瘤的新血管应用小动物眼功能荧光实时监测系统进行小鼠荧光血管造影。根据体质量,腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.003mL·g通过视觉电图测试大鼠的视觉电生理能所有待实验小鼠提前暗适应12h,根据体质量,腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.003mL·g视网膜染色麻醉处死小鼠,摘取眼球,并分离视网膜,固定于眼球专用固定液。制作石蜡切片,HE染色。正置显微镜拍照获取结果。网膜的制备麻醉处死小鼠,摘取眼球,并分离视网膜,固定于眼球专用固定液。制作石蜡切片,根据试剂盒说明进行免疫组织化学染色。于正置显微镜下拍照获取结果。统计处理各组数据均用结果渴络欣胶囊对慢性药羟苯磺酸钙组体质量及血糖水平的影响连续灌胃给药20周后,与模型组比较,渴络欣胶囊低、中、高剂量组及阳性药羟苯磺酸钙组体质量及血糖水平没有显著性差异(图1)。结果表明,渴络欣胶囊对渴络欣胶囊对金经节细胞层厚度的影响连续灌胃给药20周后,与对照组相比,模型组小鼠视网膜神经节细胞层和内网状层厚度显著降低;与模型组相比,渴络欣胶囊低、中剂量组能显著改善神经节细胞层和内网状层厚度,且显著优于阳性药羟苯磺酸钙(图2)。结果表明,渴络欣胶囊对视网膜糖尿病神经病变具有显著治疗作用。渴络欣胶囊对小鼠眼底荧光强度的影响连续灌胃给药20周后,与对照组相比,模型组小鼠血管反光增强,串珠样静脉扩展,但未见明显血管渗漏、微血管瘤或血管新生形成;渴络欣胶囊各剂量组都能显著减少眼底荧光强度(图3)。结果表明,渴络欣胶囊能够改善db/db小鼠视网膜早期微血管病变。渴络欣胶囊对小鼠视网膜功能的影响db/db小鼠连续饲养20周后,与对照组相比,模型组小鼠N1,P1和P2波振幅值显著降低;同时,渴络欣胶囊中、高剂量组与模型组N1,P1和P2波振幅值相比具有统计学意义(图4)。结果表明,连续饲养20周后,渴络欣胶囊能够显著改善视网膜功能。db/db小鼠连续饲养20周后,与对照组相比,模型组小鼠OPs波振幅各波振幅并未出现显著性差异。同时,渴络欣胶囊各组与模型组相比也未出现统计学差异(图5)。结果表明,连续饲养20周后糖尿病视网膜血液循环还未见显著性变化。小鼠视网膜组织病理学检测HE染色后,光镜下观察可见,对照组视网膜表面光滑,各层形态正常、结构清晰完整,细胞排列紧密;db/db小鼠视网膜各层明显变得模糊、细胞疏松,且各层细胞排列紊乱;渴络欣胶囊中、高剂量组能够改善视网膜水肿程度、改善各层细胞排列不规则(图6)。结果表明,渴络欣胶囊能够显著改善db/db糖尿病小鼠早期视网膜病变。模型各组gfap表达的比较与对照组相比,模型组视网膜胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)的表达并未见明显增加;同时,与模型组比较,KLX各组GFAP的表达也无显著变化(图7)。免疫组化结果表明,连续灌胃20周后,db/db小鼠并未呈现糖尿病视网膜病变的胶质化特征。渴络欣胶囊对db/db小鼠视网膜血管漏失率的影响近年来,临床研究表明中医药在治疗糖尿病并发症中扮演了越来越重要的作用DR是糖尿病患者最常见的并发症,流行病学数据表明在中国约有1/3的糖尿病患者将有视网膜病变。虽然近些年糖尿病视网膜病得到了一定的治疗,但是随着患病人数的逐年递增,DR仍然是急需解决的医学难题。目前临床主要通过眼底荧光造影进行早期DR的检测,微血管瘤、出血和硬性渗出作为判断早期视网膜病的标志本研究结果显示,渴络欣胶囊给药后对小鼠血糖和体质量并未见显著的调节作用。FFA将荧光素钠作为制影剂,当荧光素钠进入眼底血管时,通过眼底摄影机对眼底血管进行连续拍摄,并接收激发发射出的荧光,以观察视网膜动态轮回的过程,可以精确地分辨眼底病变的部位、反映病变的程度。实验结果发现db/db小鼠连续饲养20周后,并未出现显著的血管渗漏现象,但渴络欣胶囊能够降低视网膜血管的荧光强度,提示渴络欣胶囊可以缓解DR的进程。OCT能对组织进行活体断层扫描可以清楚的显示视网膜各层形态,获得视网膜内部微细结构的横断图像闪光视觉诱发电位(flashvisualevokedpotential,FVEP)反映视觉信息从视网膜到大脑皮质视觉中枢信号的传递过程,是视网膜受到光刺激后,神经冲动从神经节细胞突触、轴索、视神经到枕叶视皮质视觉产生过程中所伴发的电活动,能敏感地反映视神经各区神经元的轴索和髓鞘的完整性及功能状态视网膜组织病理检测能直观检测其损伤程度,通过HE实验证明渴络欣胶囊能够改善视网膜细胞排列