发酵与酿造技术4发酵灭菌课件

项目四发酵灭菌项目四学习目标知识目标1.知道发酵行业常用灭菌的原理和方法。2.知道无菌空气的质量要求。3.能陈述培养基灭菌的常用方法。4.能陈述影响培养基灭菌的主要因素。5.能陈述空气的除菌原理、流程和常用的方法；技能目标1.能够按照培养基灭菌工艺，进行操作和控制。2.能根据生产工艺需求，选择合理的空气净化设备。3.能认识发酵罐中主要部件，清楚它们的作用，进行实罐灭菌。学习目标知识目标请大家思考：假如你是某单位化验室的检验员，进行微生物检验时，不知什么原因培养基已受到污染，你并不知道，继续进行检验操作时，结果将如何？有哪些原因导致污染？如何避免？

请大家思考：假如你是某单位化验室的检验员，进行微生物检验时，在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？1、由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降；2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使产物的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降；3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化；4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败；5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败.为防止杂菌的污染，哪些需要灭菌？培养基、发酵设备、空气、菌种制作在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？1、由于杂菌的污染，使生背景资料（一）概念:灭菌、消毒、除菌、防腐灭菌:用化学或物理方法杀死物料或设备中所有微生物的过程。包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒:用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。除菌:

用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。防腐:

用物理或化学方法抑制微生物的生长和繁殖。（低温、高渗、缺氧、高酸度、干燥、防腐剂）背景资料（一）概念:灭菌、消毒、除菌、防腐（二）灭菌方法1、化学试剂灭菌法适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒2、射线灭菌法适用范围：无菌室、接种箱

3、干热灭菌法适用范围：金属或玻璃器皿4、湿热灭菌法适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌5、过滤除菌法利用过滤方法阻留微生物适用范围：制备无菌空气（二）灭菌方法1、化学试剂灭菌法（三）湿热灭菌原理热阻（耐热性）热死时间：即在规定温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。热阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。（三）湿热灭菌原理热阻（耐热性）2.微生物热死定律：对数残留定律在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论，微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比，即

灭菌时间取决于培养基中所含的原始微生物数（No），灭菌的程度（Nt）和k值。当Nt=0时，t=∞，

既无意义，也不可能。一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。

2.微生物热死定律：对数残留定律在一定温度下，微生物受热致比热死速率常数k

k↓，热阻↑,t↑

灭菌速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的，K值愈小，则此微生物愈耐热。10t(min)N/N0嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线10-110-210-310-451015202512111611010810510t(min)N/N0大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线10-110-210-310-424681060585654比热死速率常数kk↓，热阻↑,t↑10t(m（四）发酵设备简介

发酵罐指工业上用于培养微生物或细胞的封闭容器或生物反应装置。机械搅拌通风发酵罐主要有罐体、搅拌器、挡板、轴封、空气分布器、传动装置、冷却管、消泡器、人孔、视镜等。（四）发酵设备简介发酵罐指工业上用于培养微生物或细胞的封闭任务一培养基和发酵设备的灭菌一、灭菌温度和时间的选择

（1）灭菌温度：速率常数与T有关，这可用阿累尼乌斯方程来表示：

K＝A*e－E/RTA：比例常数；E：杀死微生物所需的活化能；R：气体常数A、E值视菌种而异，A＝1.34—1.36，一般杀死微生物的营养体的E＝200-270kj/mol，芽孢E＝400kj/mol，R＝1.987卡/K﹒mol。K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。K值越小，说明微生物的热阻越大。任务一培养基和发酵设备的灭菌一、灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择（2）对营养成分由于大部分培养基受热的破坏为一级分解反应：dC/dt＝－KC（3）反应物浓度同样K'＝A'.e－E/RT当温度从T1升至T2，灭菌速度常数K和培养基成分破坏的速度常数K'的变化情况：K1＝A'.e－E/RT1K2＝A'.e－E/RT2灭菌温度和时间的选择（2）对营养成分灭菌温度和时间的选择（lnk2/k1）/（lnk‘2/k’1）=E/E‘由于灭菌时间的活化能E>培养基成分破坏的活化能E'，所以：lnK2/K1>lnK'2/K'1，即随T升高，灭菌速率常数的增加倍数>培养基成分破坏的速率常数的倍加倍数。结论：在热灭菌过程中，同时产生微生物死亡和培养基破坏两个过，温度升高，两分过程的速率都升高，但其中微生物死亡速率随T升高更为显著。因此，我们在灭菌时选择较高温度，较短时间，以减少培养基的破坏，这就是通常所说的“高温瞬时灭菌法”。灭菌温度和时间的选择（lnk2/k1）/（lnk‘2/k’1灭菌时间的计算例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)Nt=0.001(个)k=1.8(min-1)

㏑(Nt/N0)=-kt

t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]=20.34(min)

由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，故实际保温阶段时间比计算值要短。灭菌时间的计算例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210连续灭菌时间的估算例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。解：N0=2×105(个/ml)Nt=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]=2.37min连续灭菌时间的估算例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续二.影响培养基灭菌的其它因素培养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。二.影响培养基灭菌的其它因素培养基成分4.影响培养基灭菌的其它因素pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。培养基的物理状态（颗粒大小）泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂。培养基中的微生物数量4.影响培养基灭菌的其它因素pH：pH6.0-8.0，微生三、培养基灭菌工艺（一）培养基的分批灭菌（实罐灭菌）分批灭菌就是指将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌或间歇灭菌。过程包括：升温、保温和冷却等三个阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温三、培养基灭菌工艺（一）培养基的分批灭菌（实罐灭菌）2401灭菌工艺过程分空气过滤器灭菌并用空气吹干夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽达70℃左右取样管放料管通蒸汽120℃，1×105pa保温保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定罐压接近空气压力保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水培养基降温到所需温度向罐内通无菌空气灭菌工艺过程分空气过滤器灭菌夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，（二）连续灭菌（连消）连续灭菌就是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称为连消。连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到灭菌温度（一般高于分批灭菌温度，130～160℃），短时间保温（一般为5～8min）后，被快速冷却，再进入早已灭菌完毕的发酵罐。（二）连续灭菌（连消）连续灭菌就是将配制好的培养基在通入发酵喷淋冷却连续灭菌流程发酵罐蒸汽蒸汽冷却水无菌培养基配料罐泵连消塔维持罐冷却管喷淋冷却连续灭菌流程发酵罐蒸汽蒸汽冷却水无菌培养基配料罐泵连连续灭菌流程连续灭菌流程分批灭菌与连续灭菌的比较分批灭菌与连续灭菌的比较（三）培养基与设备、管道灭菌条件（1）杀菌锅内灭菌固体培养基灭菌（2）种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌（3）空气总过滤器和分过滤器灭菌（三）培养基与设备、管道灭菌条件（1）杀菌锅内灭菌固体培（三）培养基与设备、管道灭菌条件（4）种子培养基实罐灭菌（5）发酵培养基实罐实菌（6）发酵培养基连续灭菌（7）消泡剂灭菌（8）补料实罐灭菌（9）尿素溶液灭菌（三）培养基与设备、管道灭菌条件（4）种子培养基实罐灭菌任务二空气净化（一）空气中微生物的分布空气(即大气)是一种气态物质的混合物，此外，尚有悬浮在空气中的灰尘，主要由构成地壳的无机物质微粒、烟灰、植物的花粉以及种类繁多的细菌和其他微生物所组成。

空气中常见的微生物种类及其大小

任务二空气净化（一）空气中微生物的分布

（二）发酵用无菌空气的质量标准

发酵用的无菌空气，达到以下标准：

①连续提供一定流量的压缩空气。②空气的压强（表压）为0.2～0.4MPa。③进入过滤器之前，空气的相对湿度φ≤70%。④进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10～30℃。⑤压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般取失败概率10-3为指标。也可以把100级作为无菌空气的洁净指标。（二）发酵用无菌空气的质量标准发酵用的无菌空气，达（三）空气除菌方法辐射杀菌：超声波、高能阴极射线，x射线、β射线、γ射线、紫外线(2265Å~3287Å)加热杀菌：加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量静电除菌：常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。过滤除菌：采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等等。（三）空气除菌方法辐射杀菌：超声波、高能阴极射线，x射线、β（四）空气过滤除菌的原理与介质1.过滤除菌的种类绝对过滤：过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。如聚乙烯醇缩甲醛树脂（PVF）制成的0.3m的微孔滤膜。深层介质过滤：介质的孔隙一般大于微生物细胞。如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。（四）空气过滤除菌的原理与介质1.过滤除菌的种类2.深层介质过滤的原理

微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。2.深层介质过滤的原理微粒随气流通过滤层时，由于滤层3.空气过滤除菌介质（１）纤维状或颗粒状过滤介质棉花：常用，有弹性，纤维长度适中。玻璃纤维：直径小，不易折断，过滤效果好。活性炭：要求质地坚硬，颗粒均匀。

缺点：体积大，装填费时费力，松紧度不易掌握，空气压降大。（２）纸类过滤介质——超细玻璃纤维纸

3~6张叠在一起使用，过滤效率高，压降小。缺点：强度不大（特别是受潮后）。3.空气过滤除菌介质（１）纤维状或颗粒状过滤介质发酵生产中制备无菌空气的大致过程空气空压机贮气罐冷却除油水加热空气预处理总过滤器分过滤器无菌空气

空气过滤发酵生产中制备无菌空气的大致过程空气空压机贮气罐（五）空气的预处理1.原理：除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤器寿命；措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高效前置过滤器降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵塞（因水滴）