临床分子生物学检验实验讲义

实验一实验要求与生物安全（一）实验前准备——预习并复习PCR的反应原理及基本过程（二）实验要求——严肃认真、安全规范1、不迟到早退、不无故缺席、按要求着白大褂2、保持安静和秩序、不在教室接听手机和喧哗3、听从安排，严格遵守操作规程4、公用物品及时放回5、爱护仪器设备、保持清洁卫生6、注重仪器和试剂使用的安全操作中注意事项：注意无菌操作并防止RNase污染注意移液器（枪）的使用注意离心机必须平衡防止试剂造成皮肤伤害实验二乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测【标本采集】样品可采用血清或血浆样本，血浆采用3%枸橼酸钠抗凝，抗凝剂：血液为1：9。【操作步骤】待测样品处理（将［阴性对照］、［工作标准品①］、［工作标准品②］、［工作标准品③］、［工作标准品④］与待测标本同步进行处理）(在标本处理区进行)1.1用带滤芯吸嘴吸取100μl［样品处理液A］于0.5ml离心管中。1.2加入100μl被测标本。1.3盖上管盖，振荡混匀，13000rpm离心10分钟（离心时固定离心管方向）。1.4吸弃上清（沉淀不明显，需在离心管底部沉淀对侧吸上清，应一次吸尽上清，避免搅动或碰到沉淀）。1.5再加入25μl［样品处理液B］。1.6振荡混匀，低速（2000rpm）离心数秒后，100℃干浴或沸水浴101.713000rpm离心10分钟，取上清为PCR反应模板。（上清如不立即使用，须置-20℃保存,重新使用时需13000rpm离心102.PCR试剂准备（在PCR前准备区进行）2.1取试剂盒中［PCR反应液A］、［PCR反应液B］、［PCR反应液C］室温融化混匀后，低速（2000rpm）离心数秒。2.2根据待扩增样品数按［PCR反应液A］：［PCR反应液B］：［PCR反应液C］=13.5：13.5：1的比例配制PCR反应液，并分装至PCR反应管中，每管28μl，将装有PCR反应液的反应管转移至标本处理区。3.加样（在标本处理区进行）在装有PCR反应液的反应管中用带滤芯吸嘴分别加入2μl已处理好的标本（标本处理步骤1.7的上清）。盖上管盖，转移到扩增检测区。4.PCR扩增检测（在扩增检测区进行）将反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。循环参数设定：（请参照各类仪器的操作软件进行设置）步骤温度时间循环数1UNG酶反应502分钟12预变性942分钟13变性9410秒40退火、延伸及检测荧光6030秒4仪器冷却3510秒1步骤3中60℃时荧光检测，检测通道：530nm（FAM）4.3样品设置在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型及工作标准品参数（见试剂盒内提示）。【结果分析】根据各类仪器的软件进行分析，得到各标本的HBVDNA检测结果。（基线选取6～10或6～15个循环，阈值线选在阴性对照正常扩增曲线的上方）【结果判断】1.对于500≤测定拷贝数＜108拷贝/ml的样本，报告相应的测定结果。2.对于测定拷贝数≥108拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明≥108拷贝/ml。若需精确定量，可根据所测结果，将该标本用阴性血清稀释至105～106拷贝/ml后复测。3.对于测定拷贝数＜500拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明＜500拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。4.对于HBV扩增阴性的标本（Ct无数值），报告上注明＜500拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。【注意事项】1.待检新鲜血清或血浆若不及时检测,应保存于-20℃。2.试剂盒各组份使用前请充分融化并摇匀,离心管内的试剂需离心数秒后使用。3.PCR操作各阶段应在不同实验区域进行，包括PCR扩增试剂准备区、标本处理区及PCR扩增检测区。4.在标本处理阶段建议使用负压超净台。5.应穿工作服，戴一次性手套（经常替换手套），使用一次性用品。6.PCR操作人员应具有经验和受过培训。7.操作过程中用到的超净台、移液器、离心机、扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或70%乙醇及紫外灯处理。8.实验中废弃的吸嘴应弃于含10%次氯酸的废液缸中,以防止污染。9.阴性对照、工作标准品应和待检标本平行进行操作后方可进行PCR扩增。10.使用本试剂盒检测，请按传染病实验室检查规程操作。11.血清标本的测定结果比血浆标本测定结果略低。实验三丙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)-荧光定量检测原理与用途本品从血清或血浆中提取HCVRNA，在逆转录酶作用下将RNA逆转录为HCVcDNA，在引物的指导下，以四种脱氧核苷酸为底物，通过耐热DNA聚合酶的酶促作用，对cDNA进行体外扩增。用Taqman探针法检测扩增产物。工作标准品为HCVRNA，采用外标的方法定标。本品的定量检测范围为103～107IU/ml，本品用于定量检测血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒RNA，可作为丙型肝炎的辅助诊断及疗效监控。样本种类、采集和保存方法至-80℃冻存。标本应于操作步骤标本处理(所有操作需采用无RNA酶的带滤芯吸嘴及离心管，在标本处理区进行)实验前准备1.1将裂解液置70℃加热5分钟，使试剂瓶内的结晶全部溶解。吸取1ml裂解液加到助沉剂的试剂瓶中，用吸嘴搅动，混匀后全部吸回到裂解液瓶中，混匀后备用。1.2在去抑制剂的试剂瓶中加入700用吸嘴搅动，1.3在洗涤液A的瓶子中加入6ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。1.4在洗涤液B的瓶子中加入16ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。2病毒RNA提取2.1取N个0.5ml离心管（N=标本数量+阴性对照、强阳性对照、弱阳性对照和4个工作标准品），作好标记后分别加入100入100入20去抑制剂用带滤芯吸嘴加入110无水乙醇，振荡混匀，离心数秒。2.5将作好标记的核酸提取柱插入连接管后，固定在负压装置上，将步骤2.4中的所有液体小心移入核酸提取柱。注意不要将液体溅入其它样品的核酸提取柱内。2.6开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。2.7在每个核酸提取柱内加入500μl洗涤液A，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。2.8在每个核酸提取柱内加入500μl洗涤液B，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。2.9从连接套管上取下核酸提取柱，将其放入无RNA酶的2ml离心管中，盖上管盖，14000rpm离心1分钟。2.10将提取柱放入一新的2ml离心管中（确保采用无RNA酶的离心管），小心将50μl洗脱液加在柱面中央，静置1分钟。2.11盖上管盖，10000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液12.5μl做PCR反应模板。RT-PCR试剂准备（在PCR前准备区进行）从试剂盒中取出PCR主反应液、酶混合物和荧光探针,室温下融化后离心数秒,按照待扩增标本数量x，取PCR主反应液:酶混合物:荧光探针=7:5:0.5混合，充分混匀后离心数秒，分装至PCR毛细反应管中，每管12.5μl，将装有PCR反应液的毛细反应管转移至标本处理区。RT-PCR扩增反应液配制表扩增样品数PCR主反应液酶混合物荧光探针合计1077μl55μl5.5μl137.5μl20154μl110μl11μl275μl30231μl165μl16.5μl412.5μl32245μl175μl17.5μl437.5μl加样（在标本处理区进行）1.在装有PCR反应液的毛细反应管中用带滤芯吸嘴分别加入12.5μl已处理好的标本（标本处理步骤2.11离心管中的洗脱液）。盖上管盖，离心数秒后转移到扩增检测区。PCR扩增检测（在扩增检测区进行）1.将毛细管放入LightCycler扩增仪进行扩增检测。2.循环参数设定：ProgramCyclesTemperatureTarget（℃）HoldTime（min：sec）Slope（℃/sec）AcquisitionMode115025：0020None21942：0020None3593320None55152None721520None44293320None604520Single51403020None3.荧光检测通道：F1。结果获取1.选F1或F1/F2通道，点击Quantification按纽，进入数据分析界面。2.在数据分析窗口中，将噪音线NoiseBand的位置移至刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，且CT值不出现任何数值为准（可根据仪器本身的实际情况加以调整），得到各标本的HCVRNA检测结果。结果判断本品的检测灵敏度为500IU/ml，定量测定范围为103～107IU/ml。1.定性结果判断：测定结果为0（无数值）的标本为HCVRNA阴性标本。测定结果≥500IU/ml的标本为HCVRNA阳性标本。2.定量结果判断：对于103≤测定结果≤107IU/ml的样本，提示本次测定结果在试剂盒有效定量检测线性范围内。报告上注明其测定结果。对于测定结果＞107IU/ml的样本，提示病毒含量高于试剂盒定量检测线性范围上限，所测结果仅供参考，报告上注明＞107IU/ml。若需精确定量，可根据所测结果，将该标本用阴性血清稀释至104～106IU/ml后复测。对于500≤测定结果＜103IU/ml的样本，提示病毒含量低于试剂盒定量检测线性范围下限，所测结果仅供参考，报告上注明＜103IU/ml,建议随访。测定结果为0(无数值)的标本为HCVRNA阴性标本。注意事项1待检新鲜血标本若不及时检测,应保存于-20℃2试剂盒各组份使用前请充分融化并摇匀,离心管内的试剂需离心数秒后使用。3PCR操作各阶段应