蛋白质等电点测定及性质试验

-----总结-总结蛋白质等电点测定及性质试验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉力量的关系。初步学会测定蛋白质等电点的根本方法，了解蛋白质的性质。二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本由于电中性的要求，带电外表四周的液体中必有与固体外表电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上带电外表和反离子形成了双电层的构造。在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。对于双电层的具体构造，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910Gouy1913Chapman修正了平板型模型，提出了SternStern模型。依据O.斯特恩的观点，一局部反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用〔例如德华力〕而和外表严密结合，构成吸附层〔或称严密层、斯特恩层。其余的离子则集中地分布在溶液中，构成双电层的集中层〔或称滑移面。由于带电外表的吸引作用，在集中层中度与同号离子相等。吸附在固体外表上。其余反离子则构成集中层。电势差称为ζ电势。固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。ζZeta电位表示，pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，ZetapH值即为等电点。对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒围，约1～100微米。大局部蛋白质分子的外表都有很多亲水集会变得不稳定，两种因素都消退时，蛋白质分子就会相互分散成较大的分子而产生沉淀。在质的胶凝作用。3pH中的氨基酸分子氨基形成-NH+而带正电，在碱性溶液中羧基形成-COO-而带负电：3蛋白质分子所带净电荷为零时的H值称为蛋白质的等电点。其定义为：在某一pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分别、提纯和电泳。蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。-----总结-总结在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引蛋白质在等电点时溶解度最小，最简洁沉淀析出。蛋白质等电点的测定各种蛋白质的等电点都不一样，但偏酸性的较多，如牛的酪蛋白的等电点是4.7~4.86.7~6.85.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，pH12.0~12.4。等电聚焦电泳〔IEF，isoelectricfocusingelectrophoresis〕pH等电聚焦电泳〔IEF，isoelectricfocusingelectrophoresis〕IEF的根本原理利用特别的一种缓冲液〔两性电解质〕在凝胶〔常用聚丙烯酰胺凝胶〕pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点〔pI〕的pH处〔此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷IEF的根本原理IEFpH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值渐渐增大。如前pHpH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点l。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等质混合物参加有pH梯度的凝胶介质中，在电场经过肯定时间后，各组分将分别聚焦在各自pH位置上，形成分别的蛋白质区带。体相互聚拢的现象。主要的沉淀现象有〔1〕盐析：在蛋白质水溶液中参加足量的盐类〔如硫酸铵，可析出沉淀，稀释后能溶解并仍保持原来的性质，不影响蛋白质的活性。这是一个可逆的过程，可用于蛋白质的分别与初级提纯〔2〕变性：在重金属盐、强酸、强碱、加参加肯定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，破坏水化膜，短时〕参加生物碱试剂〔含氮的碱性物质：能使生物碱沉淀或作用产生颜色0.8~1.2%25度水和有pH0.8~1.2%25度水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸取水分。当浸入水中则快速膨胀。在牛奶中以磷酸二钙、三钙或两者的复合物形式存在。构造极为简单，没有确定的分子式。分子量约为机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸取水分。当浸入水中则快速膨胀。在牛奶中以磷酸二钙、三钙或两者的复合物形式存在。构造极为简单，没有确定的分子式。分子量约为3%80%。三、器材及试剂：器材：①试管×厘米〔。②吸管1毫升〔，2毫升〔，0毫升〔。③容量瓶0毫升〔0毫升〔。④试管架。试剂：①0.01mol·L-1醋酸溶液。③1mol·L-1醋酸溶液。

②0.1mol·L-1醋酸溶液。④1mol·L-1氢氧化钠溶液〔氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定。⑤酪蛋白。四、操作步骤：制备蛋白质胶液340℃的蒸馏水。501mol·L-1氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。1mol·L-150毫升，摇匀。参加蒸馏水定容至500毫升，得到略现浑浊的，在0.1mol·L-1NaAC溶液中的酪蛋白胶体。等电点测定按下表挨次在各管中参加蛋白质胶液，并准确地参加蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，参加后马上摇匀。0.01mol·L-10.1mol·L-11mol·L-1观察HACHACHACpH010分20分(毫升)(毫升)〔毫升〕〔毫升〕分钟钟钟118.380.62——5.9217.751.25——5.6318.75—0.25—5.3418.50—0.50—5.0518.00—1.00—4.7617.00—2.00—4.4715.00—4.00—4.1811.00—8.00—3.8917.40——1.603.5蛋白质管胶液号H2O(毫升)蛋白质管胶液号H2O(毫升)蛋白质性质试验蛋白质的盐析在试管里参加1~2毫升蛋白质的水溶液，然后逐滴参加硫酸铵饱和溶液，观看现象，有无白色浑浊产生。滴加过程中不要摇动试管，现象不明显时，多加几滴硫酸铵饱和溶液。蛋白质的变性在试管里参加25分钟，观看现象。把试管里的下层物质取出一些放在水里，观看现象。3毫升蛋白质的水溶液，参加1毫升硫酸铜溶液，观看现象〔有无淡蓝色絮状浑浊沉淀产生。把少量沉淀放入盛有蒸馏水的试管里，观看沉淀是否溶解。五、思 考 题1、在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的试验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。(即正负电荷相等)，此时极易碰撞、分散而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。2、本试验中，酪蛋白质在等电点时从溶