蛋白质的提取与检测

蛋白质的提取与检测第一节细胞总蛋白的提取及含量测定【根本原理】BiuretFolin-酚试剂法〔Lowry法〕和紫外吸取法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马斯亮蓝法〔Bradford法〕与二辛可宁酸法〔BCA法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完善无缺的，都有其优缺点。③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。Lowry暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反响并产生深蓝色，在750nm氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不一样，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。G-250595nm595nm处吸光度的增加即可进展蛋白定量。BCA〔Bicinchoninicacid〕法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质复原成一价铜离子〔BiuretreactionBCA相互作用产生敏感的颜色反响。562nm处显示猛烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，依据吸光值可以推算出蛋白浓度。1【试剂配制】〔10mmol/LPMSFPMSF100ml1.5ml离心管中，-20℃保存。150mMNaCl，1mMPMSF，1mMEDTA，1%TritonX-100，4℃保存。保存。：NaCl100ml去离子水，高温灭菌后室温保存。考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250100mg，95%乙醇50ml，磷酸离子水，混匀后滤纸过滤，4℃保存。pH7.41L，常温保存备用。【操作步骤】一、细胞总蛋白的提取人乳腺癌细胞系MCF-7MDA-MB-231与食道癌细胞系EC109于含10%FBSDMEM培育基，37℃、5%CO2条件下常规培育。去除培育液后以预冷的PBS2～3遍。20～30min，不时摇动。4℃、12000rpm15min。EP管中，-20℃冻存备用。二、蛋白含量测定〔BCAP0012〕2A1BCAB(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA24小时内稳定。100uL，使终浓度为。蛋白样品在什么0.9%NaClPBS稀释标准品。16,20uL96孔板的标准品孔中，加用于稀释20uL。96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液〔PBS〕到20uL。每个样品三个重复。200uLBCA工作液，3730分钟。也可以室温放置2小时，或长孵育时间。A562，540-595nm之间的波长也可承受。依据标准曲线计算出蛋白浓度。0.60.50.4/0.60.50.4/ 0.3y=1.569x-0.1322R2=0.9975度浓0.20.10-0.100.050.10.150.20.250.30.350.40.45OD0其次节SDS-电泳【根本原理】3SDS-电泳技术〔SDSpolyacrylamedegelelectrophoresis1967WeberOsborn进一步完善。当在样品介质和聚SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以无视不计。SDSDTT〕的解聚后的蛋白质分子或其亚基与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的外形像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质-SDS复合物根本上是一样的，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种SDS-系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质分子量的大小。15～200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。因此，SDS-不仅可以别离鉴定蛋白质，而且可以依据迁移率大小测定蛋白质的分子量。【试剂配制】10%SDS：10gSDS参加100ml去离子水中，50℃水浴下溶解，室温保存。-HClTris-base，参加200ml去离子水，加去离子水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。1.0mol/LTris-HCl〔pH6.8Tris-base30.29g，参加200ml去离子溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，加去离子水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。定容至1L，室温保存。5×Loadingbuffe50%250mMTris-HC10%溴酚蓝，10%SDS。混匀后，分装于离心管中，4℃保存。10%过硫酸胺〔AP4℃保存，保存时间为2周。4TEMED4℃避光保存。去离子水于37℃下充分溶解并定容至100ml，4℃保存。留意：Acr/Bic均具有毒性，易吸附和积存，应戴手套进展操作。500ml乙醇，100ml冰醋酸，加去离子水定容至1L，室温保存。考马斯亮蓝G250蛋白染色液：0.1g考马斯亮蓝G250溶解于100ml脱色液中，混匀后滤纸过滤去除颗粒性物质，置于棕色瓶中室温保存。凝胶保存液：450ml脱色液中参加50ml甘油，混匀后室温保存。SDS-浓缩胶〔5%Acrylamide〕配方：别离胶配方【操作步骤】一、凝胶的配制与电泳〔1〕凝胶配制与上样5玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上预备灌胶。TEMED后马上摇匀即可灌胶。灌胶时使胶2/3的别离胶后应马上封胶，用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。梳子时要使梳子保持水平，浓缩胶凝固的过程中要补胶1～2次。其放入加有电泳缓冲液的电泳槽中。取出含50μ蛋白样品与×Loadingbuffe按比例充分混合，煮沸5min。加足够的电泳液后用微量加样器贴壁上样，留意不要吸进气泡。〔2〕电泳以初始电压为80V进展电泳,30min，样品进入别离胶后改为120～150V。在溴酚兰泳动至距胶下缘约1cm时即可终止电泳〔目的蛋白条带一般跑过别离胶的1/3，可依据预染蛋白Marker二、考马斯亮蓝染色电泳后的凝胶于染色液中振荡染色4h或40℃染色1h，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次。屡次变换脱色液直至凝胶背景脱净为止，为加快脱色，可略加温度。璃板上，用保存液浸湿玻璃纸包住凝胶在室温下枯燥即可。第三节免疫印迹〔WesternBlot〕【根本原理】WesternBlot中文一般称为蛋白质免疫印迹，是分子生物学、生物化学和免6根本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进展着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达状况的信息。WesternBlot与Southern印迹杂交或NorthernWesternBlot标记的二抗。经过蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。【试剂配制】1L，室温保存。7TBS：20mMTris-HCl150mMNaCl，室温保存；%Tween20TBS缓冲液。5%TBST4℃保存。【操作步骤】一、转膜PVDF3min，完全浸湿后置于入转膜液中。1～2棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多局部。从负极〔黑色板〕依次铺海绵-滤纸〔3层〕-胶-PVDF膜-滤纸〔3面。Marker观看转移效果。不断的擀去气泡；③膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路；④留意转膜时电极方向是。二、免疫反响TBST稍加漂洗，浸没(5%)2h。8传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或BSA，脱脂奶粉本钱低但不能用于磷用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。某些抗体用BSA封闭时因不明缘由可能会产生比脱脂奶粉更强的信号。1：20232h4℃过夜。洗涤：TBSTPVDF5～10min。2h。洗涤：TBST25～10min。二、DAB显色〔按产品说明书操作〕33-diaminobenzidineDAHR〔Peroxidase色不溶性产物。用于检测过氧化物酶的活性，灵敏度高，特异性好。其适用于蛋白质杂交和免疫化学，以及原位杂交染色等。DAB直接滴加在目的片段位置，避光显色至放滤纸上晾干即可观看与扫描。发光鉴定Westernblot检测系统中常用交联酶两大家族就是辣根过氧化物酶HRP-ECL或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统-包括固定化抗9AP试验常常会遇到显色背景偏高的问题，WBHRPAPAP显色底物的生成物主要是蓝紫人技巧在里面。如今由于HRP系统的化学发光系统已经不断改进，使得灵敏度不断提高，化学发光显色上与AP不相上下。就生色反响来说，AP显色得灵敏度HRP显色底物要高。HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带〔5min左右〕后滤荧光强度曝光。取出胶片马上完全浸入显影液中1-2min，