三种荧光定量PCR检测方法比较

三种荧光定量PCR检测方法比较.三种荧光定量PCR检测方法比较定量pcr：以参照物为标准，对PCR终产物进展分析或对PCR过程进展监测，从而到达评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进展的。常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：SYBRGreenI检测模式SYBRGreenI是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后，荧光增加。因此，SYBRGreenI的荧光号强度与双链DNA的数量相关，可以依据荧光号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBRGreenI的最大吸取波长约为497nm，放射波长最大约为520nm。PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。SYBRGreenI的缺点SYBRGreenI是双链就会结合发光，对PCR反响中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。SYBRGreenI的优点：SYBRGreenI的优点是由于其缺DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。水解探针模式(taqman探针)TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团放射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进展延长反响时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分别，放射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光号的产生。随着扩增循环数的增加，释整理版.Taqman探针检测的是积存荧光。PCR94℃～60℃40个循环。常FAM，TET，VIC，HEX。杂交探针模式(Beacon、FRET)分子标是一种呈发夹构造的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子标的茎环构造中，环一般为10个核苷酸长，并与目标序列互补;茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的构造。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，由于模板不存在时形成茎环构造，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，假设有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子标也是FAM，TexasRed。PCR扩增程序通常是：94～55～72℃三步法，40个循环。整理版.FRETFRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针的5`端标记FAM荧光基团，另一探针的3`端标记Red640荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，激发FAM产生的荧光，作为Red640基团的激发光被吸取，使Red640发出波长为640的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640波长的荧光。由于FRET探针是靠近发光，所以检测号是实时号，非累积号。常用的荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705。整理版.能用于实时荧光PCR定量的方法很多，各有优缺点，应依据试验的需要和当前的试验条件选择适合自己的方法。下面为各种方法的比较：整理版.试验中的一些好习惯：参加试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均;移液用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。;多和大家争论，同时多关注别人争论的阅历，这几乎是最快提高的捷径了;全部的试剂都自己配，出了问题才好找缘由。RNA酶污染的措施：全部的玻璃器皿均应在使用前于10℃的高温下干烤6h或更长时间。0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(留意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用)。有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，3%H2O210min0.1%DEPC水冲洗，晾干。配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hDEPC。不能高压灭菌的试DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，试验过程中手套要勤换。设置RNA操作专用试验室，全部器械等应为专用。RNA酶抑制剂：焦磷酸二乙酯(DEPC)RNA酶RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞构造RNA酶有猛烈的变性作用。氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制RNA酶结合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有肯定抑制作用。DEPCRNA，因此在分别和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在全部RNA试验中，最关键的因素是分别得到全长的RNA。而试验失败的主要缘由是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。整理版.RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。RNA酶最主要的潜在污染源是争论RNA试验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反响,因而含Tris和DTT的试剂不DEPC处理动植物总RNA提取-Trizol法：Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培育细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+RNase封阻分析和分子克隆。N50-100mg组织参加1mlTrizolTrizol体积10%。研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液参加0.2ml15秒。mlTrizol0.5ml异丙醇的比例参加异丙醇，室温放置10分钟，g离心10分钟。弃去上清液，按每mlTrizol液参加至少1ml的比例参加75%乙醇，涡旋混匀，4℃7500g5分钟。留神弃去上清液，然后室温或真空枯燥5-10分钟，留意不要枯燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进展mRNA70%乙醇并保存于-70℃。[留意]整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步肯定要留神，靠近沉淀的局部肯定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值加氯仿前的匀浆液可在-70℃RNA沉70%4℃保存一周，-20℃保存一年。mRNA的提取阅历：一、关于TrizolReagent需要的试剂Chloroform：氯仿(分析纯)Isoprolalcohol：异丙醇(分析纯)整理版.75%Ethanol(inDEPC-treatedwater)：75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。RNase-freewater：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%(V/V)加在dH2O中500ml(50ul)，在37℃过夜，并高压灭菌即得(1小时)一次性塑料手套留意：DEPC有致癌之嫌二、关于TrizolReagent的使用过程：Homogenization(匀浆)Tissues：组织每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol10%。CellsGrowninmonolayer(单层细胞接毒后消灭病变的)JEVRNA的抽提法：BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml(承受大瓶)，37℃1h，倒掉，加维持液(2%HEPEMEM)约5ml，维持天。消灭75%-100%的病变时，以PBS(预冷)冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中参加Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞(细胞瓶有两种常用规格：大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.ml。Trizol试剂的参加是依细胞瓶而定，以盖满瓶底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致DNA的污染)具体方法如下：(样品肯定要颖)EPTrizol1ml/10cm2()，混匀，吹吸几次，5min，以使核蛋白复合物彻底分别。加氯仿0.2ml(每1mlTrizol试剂参加氯仿0.2ml)，盖好，15s2-3分钟。4℃离心，g×15min，离心后，混合物将分别为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol60%。认真吸取上层水相，移至另一EP管中。加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA(每1mlTrizol试剂参加0.5ml异丙醇)10min。4℃离心，g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透亮的小块附在管底和管壁。整理版.75%1ml(1mlTrizol试剂参加75%乙醇至少1ml)，震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。弃上清液，空气枯燥(或真空枯燥)后，沉淀重悬RnasedH2O中，吹吸几次，55℃-60℃10分钟以溶RNA，-70℃保存备用。(9)分别组织10mg(纯组织)加00ulTrizol试剂。(10)扩增产物的鉴定。DEPC处理方法如下：DEPC处理：DEPC水：100ml超纯水参加0.2mlDEPC，充分混匀，高压灭菌。Tip头(头)、EPRNART时接触RNA的器材(包括1ml、200μl、20μlTip头;EP管和PCR反响管等)：用0.1%的DEPC水(1000ml超纯水参加1mlDEPC)37浸泡过夜，高压灭菌。提取RNADEPC水溶解。RTPCRRT是PCR反响管中作的。操作过程中要戴一次性手套，并常常换手套。最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，1-2ml0.1%DEPC水，在灭菌就行了;RNASEFREE的头买，直接用不用处理的。如何消退污染：机器运行完后，取出PCR产物时不能任凭丢弃，应当用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。试剂：mixer尽量分装，不要原瓶屡次取用。加样：原则是DNA最终加，其他试剂依据体积大小从DNA不同，那么实行的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避开误差及污染。另外，一般试验室简洁污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最简洁造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。整理版.RNA定量：RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。RNA的贮藏，最主要的是温度，-20不够，最好-0，液氮最保险。mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，由于还有翻译效RNA降解速度的影响。RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进展一步法进展;假设条件不太好的话可分两步进展逆转录再PCR。两步法的结果更加抱负，条带特异性强且无拖尾现象，由此推想是体系更加单一比较利于PCR的进展。肯定要做内参的，不作内参的结果是不行的。电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是确定表mRNA的分别与纯化中。步骤(4)中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏 RNA的二级构造，尤其是mRNAPoly(A+)尾处的二级构造，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。保温试验：方法很简洁的，依据样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000ngRNA0.5mlpH7.0的Tris10ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中，保温1h。另一份放置在-20℃冰1h。时间到了之后，取出两份样本进展电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。假设两者的条带全都或者无明显差异(固然，它们的条带也要符合方法2中的条件)，则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，假设70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。PCR污染与对策：PCR扩增产物污染.这是PCR反响中最主要最常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如头等要留意。还有一种简洁无视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液风光摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较猛烈