产解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定

产解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定

纤维是世界上丰富的可再生资源。利用纤维素类物质对解决全球能源危机具有重要意义。我国是个农业大国,秸秆总产量居世界首位,每年产生约8×10纤维素酶是由多种可降解纤维素生成葡萄糖的水解酶组成的复杂酶系,因此定义为纤维素酶系。根据纤维素酶组分在降解纤维素过程中作用的不同,将纤维素酶分为3类,分别为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶目前,国内DNS测纤维素酶活法多使用分光光度计来测量吸光值,且反应体系都在试管中进行。测量过程步骤复杂,耗时时间长、粗酶液样品需求量大,不利于大批量样品快速检测酶活。本实验采用Kim近年来,离子束在改良生物材料方面的应用与发展十分迅速。离子束具有损伤轻、突变率高、突变谱广、诱变育种技术稳定可靠、简便易行、重复性好等优点,且诱变效应是局部、可选择、可控的1材料和方法1.1材料表面1.1.1样品采集1.1.2培养基CMC-Na初筛培养基(g/L):CMC-Na10.0g/L,NaCl5.0g/L,KH1.1.3刚果红试剂的制备3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)配置方法:酒石酸钾钠182.0g,溶于500mL蒸馏水中,加热(不超过50℃),于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g、NaOH21.0g、苯酚5.0g、无水亚硫酸钠5.0g,搅拌至完全溶解,冷却后用蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中,避光室温保存两周后使用刚果红试剂:刚果红1g/L。亚甲基蓝染色剂:亚甲基蓝1g/L。1.1.4压力蒸汽灭菌锅ZHP-230落地冷冻摇床:常州普天仪器制造公司;YXQ-LS-SOSII型立式压力蒸汽灭菌锅:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;离心机Allegra1.2方法1.2.1cmc-na双筛培养专菌落将收集到的土样与无菌水充分混合,过滤去除残渣。收集样品过滤后的滤液,取适量滤液上清液进行梯度稀释,将稀释液涂在CMC-Na初筛培养基上,30℃恒温培养,出现菌落后反复划线、纯化培养,获得纯菌落。1.2.2菌落直径和透明圈直径测定将纯化后的菌落分别点种在CMC-Na初筛培养基上,每个培养基点3个样,30℃培养3d,用1g/L刚果红染液染色20min,弃去染液,加入1mol/LNaCl溶液,洗涤5min后弃去NaCl溶液,测量菌落直径和透明圈直径,分别用D和H来表示。根据透明水解圈直径和菌落直径的比值(D/H)大小初步判断菌株产纤维素酶的能力,选取比值大的菌株进行后续研究。1.2.3srrna基因多态性pcr检测将出发菌株进行分子鉴定,取摇瓶180r/min,培养3d的菌液离心,提取DNA。以所提取的DNA为模版,使用细菌的通用引物27F和1492R进行16SrRNA基因的PCR扩增。扩增体系为50μL(10×Buffer5.0μL,MgCl1.2.4菌体诱变致死率测定将出发菌株在CMC-Na生长培养基上30℃培养2d。用接种环挑取适当菌体到4mL的诱变保护剂中,并用震荡器使菌体在诱变保护剂中均匀分布制成菌悬液,然后测量菌悬液的OD诱变致死率公式:致死率=1-诱变后存活菌株数/原始菌株数正突变率公式:正突变率=发生正突变的菌株数/样本菌株数1.2.6形态特征观察用接种环点种出发菌株与突变菌株在CMC-Na生长培养基上30℃培养96h后,观察单菌落形态特征。同时用亚甲基蓝试剂对菌体进行染色,并在1000倍显微镜下进行镜检。1.2.7菌株的筛选和酶活测定初筛:辐照后的菌株在CMC-Na液体产酶培养基中37℃,160r/min摇床培养12h后,稀释涂布于CMC-Na生长培养基上。30℃培养48h后,从平板上挑取单菌落进行编号,通过画线扩大培养。将培养好的菌株用无菌枪头或牙签接种至装有2mLCMC-Na产酶培养基的试管中。放入37℃,180r/min的摇床中培养24h后,酶标仪测其酶活。复筛:将初筛CMC酶活较高的突变菌株挑出,传代培养5代后。每个突变菌株以5%的接种量,在37℃,180r/min摇床培养24h后,测其CMC酶活。1.2.8羧甲基纤维素钠溶液配制本实验所测CMC酶活为内切葡聚糖酶活,CMC酶活测定采用酶标仪高通量测定法。测定样品如图1所示。取待测粗酶液20μL于96孔板中,加入20μL1%的羧甲基纤维素钠溶液(pH为5.0的磷酸缓冲液配置)。40℃水浴反应30min,然后加人160μLDNS试剂,用铝箔包好96孔板,防止挥发,放入120℃的鼓风干燥箱中烘烤20min,然后用酶标仪在540nm波长下测定光吸收值,并从葡萄糖标准曲线上计算得出相对应的葡萄糖含量,进而计算酶活酶活力定义为:在适当的温度和pH值条件下,每1min内1mL酶液水解相应的底物转化成1μg还原糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)。2结果2.1产纤维素酶活性测定结果从含腐败秸秆的土壤中分离出7株纤维素酶产生菌,它们的透明圈直径(D)、菌落直径(H)、D/H,以及培养24h后CMC酶活的测定结果,如表1所示。其中S-1的D/H比值为2.33,CMC酶活为6.88U/mL,S-1表现出较高的产纤维素酶的能力。S-1在初筛培养基上的菌落形态及刚果红染色后形成的透明圈如图2所示。根据出发菌株S-1的16SrRNA的序列,选择同源性较高的菌株构建系统发育树如图3所示。结合理化特征,将菌株S-1鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。2.2诱导突变致死率选择CMC酶活较高的S-1作为出发菌株,进行离子束诱变,诱变剂量的选择参照离子束诱变细菌的剂量,离子束诱变在6个不同N2.3芽孢形态观察在离子束诱变后的单菌落传代培养过程中,发现有部分菌株菌落形态发生变化,如突变菌株308。如图4所示,出发菌株S-1单菌落呈白色,圆形,中央突起,不透明,突变菌株308单菌落呈乳白色,圆形,表面粗糙,有皱褶,中央突起,边缘透明。突变菌株308与出发菌株S-1相比形成的单菌落较小。将出发菌株S-1与突变菌株308用亚甲基蓝溶液染色后在1000倍显微镜下进行观察,发现突变菌株308的芽孢形态发生变化。出发菌株S-1的芽孢呈椭圆形,而诱变菌株308的芽孢呈圆形。低能N2.4选择不同基因的菌株进行遗传稳定试验低能N3采用酶标仪测cmc酶活法近年来,通过诱变法提高产纤维素酶菌株产纤维素酶能力的研究取得了较好的进展。埃及科学家El-Ghonemy等与传统的分光光度计测酶活法相比,运用酶标仪高通量测CMC酶活法提高了工作效率,克服初筛过程中样品量大的问题,也使初筛结果更为直观。选用CMC酶活作为初筛指标可以更直观的筛选出产酶较高的突变菌株,使整个筛选体系更简便,筛选数据具有更高的说服力。4结论从含腐败秸秆的土壤中筛选出产纤维素酶较高的菌株S-1,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌。并运用低能N样品采自含腐败秸秆的土壤。1.2.5诱