罗伊氏乳杆菌代谢添加方法

精品文档-下载后可编辑罗伊氏乳杆菌代谢添加方法1前言

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)是卫生部于2022年批准的新型益生菌，该菌常栖息于人和动物的肠道系统中，其代谢产物可抑制其它微生物的生长，因此引起广泛研究兴趣，在生物防腐剂[1,2]、生物灭菌剂[3]、口香糖添加剂[4]和抗感染治疗剂[5]等方面应用的研究层出不穷。罗伊氏乳杆菌具抑菌特性的主要原因在于其代谢甘油过程中形成的中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)，该物质可抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌、病原虫、原生动物等的生长[6~8]。甘油在微生物体内一般经依赖于辅酶B12的甘油脱水酶[9]转化为3-羟基丙醛，3-羟基丙醛在依赖于辅酶NADH的1,3-丙二醇脱氢酶作用下会进一步还原为1,3-丙二醇(1,3-PD)，因此微生物一般不向胞外分泌3-羟基丙醛，而是直接在胞内进一步代谢成1,3-丙二醇后分泌出胞外。罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)是目前发现的可向胞外分泌较多3-羟基丙醛的菌株，该菌广泛分布于人及动物的肠道[10~13]。Peng等[14]对培养基的研究表明，用葡萄糖、甘油及混合碳源分别培养L.reuteri，发现其不能以甘油为唯一碳源生长；在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长时，无3-羟基丙醛生成；在葡萄糖和甘油的混合培养基中生长时，才会生成3-羟基丙醛和1，3-丙二醇。因此研究甘油的添加策略对L.reuteri分泌3-羟基丙醛和1,3-丙二醇的影响具有重要意义。本文针对细胞不同生长期添加甘油，考察L.reuteri代谢过程中葡萄糖、乳酸、乙酸、乙醇、甘油、3-HPA和1,3-PD浓度随时间的变化情况，分析了甘油添加时机对代谢的影响。在研究基础上，通过选择甘油添加策略调节L.reuteri代谢产生的抑菌物质3-HPA，可为环境微生物和食品微生物中常采用的混菌培养过程中控制其它微生物的水平，提供必要的指导；同时研究结果对共底物培养生产3-HPA和1,3-PD也有实际的参考意义。

2实验材料与方法

2.1菌种与试剂罗伊氏乳杆菌(L.reuteriCG001)，由本实验室筛选保藏于?80℃的甘油管中，甘油管为含6%脱脂奶粉和10%甘油的溶液。使用时，罗伊氏乳杆菌接种于MRS培养基中，37℃下摇瓶转速200r?min?1厌氧培养15h待用。所用试剂均为市售分析纯。

2.2罗伊氏乳杆菌发酵培养基组成及培养条件酵母膏浓度20g?L?1，葡萄糖浓度20g?L?1，柠檬酸铵浓度1g?L?1，醋酸钠浓度7g?L?1，磷酸氢二钾浓度3g?L?1，硫酸锰0.18g?L?1，硫酸镁0.2g?L?1，吐温801g?L?1。初始pH5.5，培养温度37℃，批式培养接种量为2%，连续通氮气保证厌氧环境。所用发酵罐为Biostat5(B.Braun,Germany)，工作体积为5L，pH、温度、搅拌速度自动控制，为保证厌氧环境，通气速率为0.2vvm(指单位时间内通过单位液体体积的气体体积)。

2.3添加甘油策略的研究(1)在发酵初始时加入甘油：在发酵初始时加入葡萄糖(30mmol?L?1)和甘油(200mmol?L?1)，作为共底物，其它培养基组成不变，在pH=5.5、37℃、150r?min?1下开始厌氧培养及转化，每隔一定时间取样检测菌浓及代谢物的浓度。(2)在细胞生长对数期加入甘油：按优化过的MRS培养基配发酵液，发酵罐pH=5.5、37℃、150r?min?1厌氧条件下培养8h后，补加200mmol?L?1甘油于发酵液，开始转化，在发酵和转化过程中取样检测3-HPA和各代谢物的变化情况。(3)在细胞生长静止期加入甘油：按优化过的MRS培养基配发酵液，发酵罐pH=5.5、37℃、150r?min?1厌氧条件下培养20h后，经检测葡萄糖基本消耗完全，补加200mmol?L?1甘油于发酵液，开始转化，在发酵和转化过程中取样检测3-HPA和各代谢物的变化情况。

2.4菌浓的测定罗伊氏乳杆菌浓度由浊度法测定。预先建立菌浓与600nm处吸光值的标准曲线，细胞培养过程中测定600nm处吸光值对应出菌浓。

2.5葡萄糖、乳酸、乙酸、乙醇、甘油和1,3-丙二醇的测定葡萄糖、乳酸、乙酸、乙醇、甘油和1,3-丙二醇的测定使用AgilentHPLC1100.分离条件为：AminexHPX-87H柱，60℃下操作，5mmol?L?1H2SO4为洗脱液，流速为0.6mL?min?1，检测器为折光示差检测器[14,15]。2.63-羟基丙醛的检测3-HPA无标准品，采用衍生化比色法测定[15,16]。衍生液为0.05mmol?L?1溶解的色氨酸溶液，浓度为10mmol?L?1。每毫升样品加入0.75mL衍生液，然后加入3mL37%盐酸溶液，37℃温浴20min，测560nm处吸光值。以丙烯醛为标准物作标准曲线，待测液中3-HPA浓度可根据标准曲线得出。3结果与讨论

3.1不添加甘油发酵图1是L.reuteriCG001在厌氧条件下，葡萄糖为唯一碳源时的代谢曲线，乳酸、乙酸、乙醇是主要代谢产物，表现为典型的异型乳酸代谢特征。通过JGI(/cgi-bin/pub/main.cgi)数据库查询该菌的代谢途径可知，L.reuteri通过5-磷酸木酮糖途径将葡萄糖转化为乳酸、乙酸、乙醇。图1结果显示，该菌在厌氧条件下，经12h发酵进入静止期，最终菌浓约为1.5g?L?1左右；消耗的葡萄糖主要生成乳酸和乙醇，葡萄糖约经16h被完全转化，生成乳酸和乙醇浓度分别约为12.6g?L?1和4.0g?L?1，乙酸浓度变化很小。

3.2发酵初始添加甘油作为共底物图2是在发酵初始时加入葡萄糖(30mmol?L?1)和甘油(200mmol?L?1)厌氧条件下培养时，菌浓、底物及相应代谢物浓度随时间的变化曲线。由图2可知，在甘油与葡萄糖作为共底物培养时，其代谢特征与葡萄糖为唯一碳源时差别较大。经6h发酵，细胞生长对数期基本完成，大部分葡萄糖被消耗，残余葡萄糖浓度为0.5g?L?1，生成菌体浓度约为0.9g?L?1，生成乳酸3g?L?1，净生成乙酸约1g?L?1，生成乙醇0.4g?L?1，因此可见其代谢向乙酸途径迁移。在前2h甘油代谢同时生成3-HPA和1,3-PD，之后3-HPA浓度逐渐趋于0，而1,3-PD浓度高达38mmol?L?1，3-HPA与1,3-PD浓度的变化反映了胞内NADH的情况，在NADH较充足的情况下易生成1,3-PD，而菌在前6h生成了较多的乙酸，正反映了其代谢从乙醇途径迁移的过程。乙醇途径每生成1mol乙醇消耗2molNADH，而代谢迁移到乙酸途径后，结余的NADH促进1,3-丙二醇脱氢酶转化3-HPA向1,3-PD的过程，因此生成较多的1,3-PD。因此L.reuteri菌胞内NADH会优先用于甘油途径。6h后细胞迅速开始衰亡，可能是乙酸和3-HPA对微生物的致死作用导致，此后残余的葡萄糖的缓慢消耗用于微生物的活性维持，由于NADH被1,3-丙二醇脱氢酶途径转化为NAD，胞内的NADH/NAD下降，从而细胞又积累了8mmol?L?1的3-HPA，加速了细胞的死亡。

3.3在细胞生长对数期加入甘油厌氧条件下培养8h后，在细胞对数生长期加入甘油，各代谢物浓度的变化情况如图3所示。甘油立即开始消耗，生成3-HPA和1,3-PD，但3-HPA生成速率小于1,3-PD；葡萄糖消耗速率降低，乙酸和乳酸缓慢生成，乙醇浓度几乎不变。因此推断在对数生长期加入甘油后，L.reuteri立即由乙醇途径向乙酸途径迁移，以适应甘油途径对NADH的需求。12h后补加新鲜培养基，甘油和葡萄糖的消耗速率均加快，生成1,3-PD和乳酸的速率也加快，并表现出一定的同步性；而3-HPA浓度迅速降低到检测不出。经24h培养，菌浓高达1.75g?L?1。对数生长期加入甘油会引起代谢途径的缓慢迁移，细胞经过一段时间的适应后，会迅速采取对自己生存最合理的方式来调节代谢，产生最少的3-HPA，调节胞内NADH/NAD的比例以适应细胞的生长。因此在残余较多葡萄糖的对数期加入甘油，细胞并不会积累较多的3-HPA，不利于其抑菌作用的发挥。3.4在细胞生长静止期加入甘油厌氧条件下培养20h后，在细胞生长静止期加入甘油，各代谢物浓度的变化情况如图4所示。细胞在培养12h后，菌浓1.3g?L?1左右，之后菌浓基本不变，在16h后培养基中的葡萄糖基本消耗完全，在细胞生长静止期(20h)加入甘油，之后2h内，3-HPA浓度达到最高约20mmol?L?1，1,3-PD浓度达到约13mmol?L?1。而同时乳酸浓度约下降3g?L?1，乙酸浓度约增加1.7g?L?1，乙醇浓度约增加1g?L?1，因此有乳酸重新进入代谢途径。由乳酸到乙酸的代谢途径可知，该过程中每摩尔乳酸可生成1mol乙酸，并同时生成2molNADH，生成的NADH可用于3-HPA向1,3-PD过程的转化所需。而乳酸到乙醇代谢途径表明，每摩尔乳酸可生成1mol乙醇，但此过程不会有NADH生成。图中同样可以看出在20h后随着3-HPA的生成，菌浓逐步下降，这与3-HPA对L.reuteri菌自身的致死效应相吻合。因此若希望积累较多的3-HPA提高其抑菌特性，在静止期加入甘油应是较好的选择，但较高的甘油浓度可能对该过程并不利。为生成较多的3-HPA并避免其进一步转化，有效的甘油添加策略应是在静止期添加低浓度甘油，在自身菌浓降低到一定程度时，重新补加葡萄糖，以促进菌浓的恢复，通过批式交替补料以维持L.reuteri菌产生抑菌物质3-HPA，并维持在一定浓度，从而抑制其它微生物的生长。

4结论

在发酵罐中厌氧培养L.reuteriCG001，呈现典型的异型乳酸发酵特征，细胞在12h后进入静止期。通过在细胞不同生长期加入甘油的考察结果表明，L.reuteri在以甘油和葡萄糖作为共同培养基时，细胞代谢会向净生成NADH的途径迁移，以满足甘油向1,3-PD转化途径中NADH的需求，从而尽量减少分泌3-HPA造成对自身的伤害。在对数期加入甘油，胞外检测到的3-HPA极少，若葡萄糖过量，基本在胞外检测不到3-