第8章-基因工程原理2课件

第8章基因工程原理PrinciplesofGeneEngineering本章内容1基因工程的历史和发展2基因工程的基本内容和技术3基因工程相关酶学4基因工程中的载体和宿主系统5目的基因的获得和分离方法6外源基因导入宿主细胞7重组体的鉴定和分析8外源基因在大肠杆菌中的表达9外源基因在真核细胞中的表达10蛋白质工程11基因工程的应用和展望

5目的基因的获得和分离方法PrinciplesofGeneEngineering常见的目的基因的获得方法5.1基因的人工化学合成5.2基因文库的构建基因组文库，cDNA文库5.3PCR法PrinciplesofGeneEngineering5.1基因的人工化学合成20世纪50年代，KhoranaHG就开始了寡核苷酸的化学合成，并于1956年首次成功合成了二核苷酸。从此开始了核酸的人工化学合成，他获得1968年诺贝尔生理学核医学奖（与他人共享）。他合成了酵母丙氨酸tRNA基因，并在1979年首次合成出具有生物活性的126bp长度的大肠杆菌酪氨酸tRNA基因。PrinciplesofGeneEngineering核酸化学合成的指导思想就是，将核苷酸所有的活性基团都用保护剂加以封闭，只留下需要反应的基团，用活化剂使反应基团激活；用缩合剂使一核苷酸羟基与另一个核苷酸磷酸基团之间形成磷酸二酯键，从而定向发生聚合。PrinciplesofGeneEngineeringDNA的化学合成的方法刚开始是磷酸二酯法，后来1960年Letsinger等又发明了磷酸三酯法，后来又出现了亚磷酸三酯法。进一步的发展出现了固相化，即将第一个核苷酸的3’-OH固定在可控孔径玻璃微球（CPG）上，因此，冲洗十分的方便，由此出现了DNA自动合成仪。目前的DNA自动合成仪都使用亚磷酸三酯法。PrinciplesofGeneEngineering腺嘌呤、胞嘧啶碱基上的氨基用苯甲酰基（bz）保护，鸟嘌呤碱基上的氨基用异丁酰基（Ib）保护，5‘-OH用二甲氧三苯甲基（DMT）保护。合成的每个循环周期分为4个步骤：脱去保护基、偶联反应、封端反应和氧化反应。PrinciplesofGeneEngineering第一步：脱去保护基:用酸处理，使核苷酸5‘-OH上面的保护基DMT脱落。第二步：偶联反应：使用二异丙基氨基亚磷酰氯甲酯作为活化剂和缩合剂，在弱碱化合物四唑催化下，了、偶联形成亚磷酸三酯。第三步：封端反应：加入乙酸酐使没有参与偶联反应的5’-OH被乙酰化，以免参与反应，出现错误序列。第四步：氧化作用：合成亚磷酸三酯后用碘氧化，形成较为稳定的磷酸三酯。PrinciplesofGeneEngineering按照事先设计好的顺序逐个加入核苷酸，合成结束后，使用硫酚核三乙胺脱掉保护基，并用氨水水解合成的寡核苷酸，再用HPLC和凝胶电泳纯化鉴定。每个核苷酸的合成循环需要7-10分钟，50个核苷酸的DNA片段需要6-8小时，十分迅速方便。PrinciplesofGeneEngineering人工合成基因的基本程序a利用化学方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡聚核苷酸的短片段，再退火成为两端活性末端的DNA双链片段；b将上述的DNA片段按照正确顺序进行退火，连接形成较长的DNA片段，再用连接酶连接，形成具有完整编码序列的DNA；c将完整编码的DNA与载体连接，导入合适的宿主细胞中，实现分子克隆。目前，还可以采用化学（连接）酶促相结合的方法合成寡聚核苷酸，可以提高反应的专一性，减少副反应，提高产率等。PrinciplesofGeneEngineering短的寡核苷酸片段连接成长的基因的两种方式小片段互补粘接大片段部分互补酶促PrinciplesofGeneEngineering化学合成寡核苷酸的应用（1）合成分子杂交的探针；（2）合成PCR引物和DNA测序使用的引物；（3）合成短小的或来之不易的基因，或改造天然基因；（4）合成DNA末端改造中的接头；（5）制备cDNA，筛选文库，克隆基因；用于基因定位和基因的专一性改变等。PrinciplesofGeneEngineering人工合成基因的缺点合成的基因容易出现重复结构、发卡结构或回文结构，从而造成拼接效率下降或拼接错误；小肽基因都比较短小，一般均采用化学合成的方法获得其基因，如生长激素释放因子基因（14肽）、缓激肽、胸腺素-2、脑啡肽、加压素、β干扰素、γ干扰素、人胰岛素等。PrinciplesofGeneEngineering5.2基因文库的构建PrinciplesofGeneEngineering基因组文库（genomiclibrary）：指整套由基因组DNA插入克隆载体所获得的分子克隆的总合，其中应该包含有生物的全部遗传信息。基因文库包括两种：cDNA文库（cDNAlibrary）:

指细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总合。PrinciplesofGeneEngineering基因组文库的构建一个基因组文库中应该含有多少克隆数目，才能保证所要求的基因以极高的频率出现在文库中？基因文库大小N=ln(1-P)ln(1-F)N=基因文库中所包含的克隆的数目P=任意所需基因存在于基因文库中的概率，一般要求大于99%F=所克隆的DNA片段大小（kb）占基因组大小的分数。根据公式可以计算出各步应该达到的数量。PrinciplesofGeneEngineering如某动物单倍体基因组含有3X109bp，使用噬菌体为克隆载体，所克隆的片段大小为20kb左右，为了使目的基因存在于基因组文库的概率大于99%，则文库中的克隆数目为69X105。大肠杆菌基因组为4.6X106，那么大肠杆菌基因文库的克隆数是1100。由于原核生物基因组中不含有内含子，所以可以认为原核生物的基因组文库与cDNA文库相同，但是真核生物就完全不同。PrinciplesofGeneEngineering基因组文库的构建过程染色体DNA的提取载体的制备DNA部分酶切合适大小DNA片段的回收体外连接成重组分子转化或感染进入宿主细胞收集含有重组子的菌落，组成基因组文库文库的鉴定和扩增文库的保存基因组文库的具体构建过程可因材料、载体和宿主细胞的不同而有所差异。PrinciplesofGeneEngineering基因组文库的构建PrinciplesofGeneEngineering基因组文库构建的几点说明（1）提取基因组DNA时，要保证获得大片段的DNAPrinciplesofGeneEngineering（2）目前多用部分酶切的方法使基因组DNA片段化。（3）酶切后“合适大小”片段的确定根据具体的实验而定。（4）载体种类的选择要根据实验目的和要求而定（5）基因组文库的鉴定就是要检查库的容量，也就是文库中包含的克隆数，指菌落数或者形成的噬菌斑数目。PrinciplesofGeneEngineeringcDNA文库的构建cDNA文库构建的基本原理真核生物基因的结构核表达控制元件与原核生物有很大不同，最大的差异就是具有内含子序列；其次，真核生物的基因在某个给定的时刻只有部分表达，而且存在空间上的差异，许多mRNA基因具有组织特异性。mRNA由于不稳定，所以研究时一般都反转录成cDNA进行。为了研究基因的结构、基因的表达谱以及将真核基因放在原核细胞中表达等，必须分离基因的cDNA，由此必须构建基因的cDNA文库。PrinciplesofGeneEngineering真核生物的各种基因表达丰度有很大的差异，有的有几十万个拷贝，有的只有几个拷贝。从文库中克隆高丰度基因特别容易，但是克隆低丰度的基因却比较困难。为了使低丰度基因的克隆存在的概率大于99%，cDNA文库中应该包含有的克隆数可以根据下面的公式计算：N=ln(1-P)ln(1-1/n)N=cDNA文库中包含的克隆数目；p=低丰度cDNA存在于文库中的概率，一般要求大于99%；1/n=每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数PrinciplesofGeneEngineering例如，人的成纤维细胞mRNA经过分子杂交动力学研究，一共有12000种分子，其中低丰度mRNA占总mRNA的30%，为11000种，所以n=11000/30%，为3.67x104，带入上面公式，得到N=1.69x105。PrinciplesofGeneEngineering构建cDNA文库的基本步骤组织或细胞培养载体提取总mRNA反转录为cDNA体外连接为重组分子转化重组子进入宿主细胞收集含有重组子的细胞组成cDNA文库文库的鉴定和扩增文库的保存cDNA文库的要求（1）含有各种稀有mRNA克隆；（2）克隆的cDNA应该是全长的，保留基因的5‘端序列。PrinciplesofGeneEngineeringcDNA两条链的合成（回折法）PrinciplesofGeneEngineeringcDNA文库的特点：优点（1）文库筛选比较容易；（2）得到基因的cDNA序列中无内含子，可以用来研究基因的结构和功能，可以进行表达获得蛋白质产物；（3）利用cDNA做探针，可以认识了解染色体结构变化对基因表达的调节作用等。局限（1）cDNA不含基因的内含子序列和基因的调控序列等。（2）低丰度基因有时难以在文库中得到体现，难以分离。PrinciplesofGeneEngineering文库质量的鉴定PrinciplesofGeneEngineering5.3PCR法PCR是聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）的简称，是DNA的体外酶促扩增，又称为“无细胞分子克隆法”。1985年由MullisK发明，为此他获得诺贝尔奖。KaryMullisPrinciplesofGeneEngineeringPCR的基本原理PCR方法模仿体内DNA复制的过程，首先是使DNA变性，两条链分开，然后使用引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以四种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的新的DNA链，重复此过程，DNA以指数方式扩增。PCR扩增时需要两种引物，5’端引物和3‘端引物。5’端引物又叫正向引物、上游引物，3’端引物又叫反向引物、下游引物。PrinciplesofGeneEngineeringPCR操作简单，只需要加入试剂并控制3步温度和时间即可，扩增效率惊人：产量=（1+扩增效率）循环次数PrinciplesofGeneEngineering12138192241416384381532768416166553653217131072664182621147128195242288256201048576951222419430410102424167772161120482667106864124096301073741824PrinciplesofGeneEngineeringPCR的基本过程分为三步：（1）模板变性：一般在94-95C进行变性3-5分钟。（2）退火：在合适的温度下，引物和模板结合（3）引物延伸：在72C条件下，DNA聚合酶合成出新DNA链PrinciplesofGeneEngineeringPCR过程PrinciplesofGeneEngineeringPCR反应条件控制要点（1）引物的设计：引物的质量与PCR的成败有最直接的关系（2）引物与模板的退火温度：（3）反应缓冲液中的Mg2+浓度；（4）模板：太多会影响反应，最少可到皮克级。（5）DNA聚合酶：目前均使用耐热的DNA聚合酶（6）四种dNTP

浓度要一致。PrinciplesofGeneEngineeringPCR技术的发展与应用举例（1）PCR技术的新发展：巢式PCR、复合PCR、RT-PCR、锚定PCR、反向PCR、不对称PCR、重组PCR等等。（2）PCR用于特异性探针的合成（3）用于DNA的测序（4）产生和分析基因突变（5）重组PCR将DNA的不同序列连接在一起。（6）未知序列的PCR扩增（反向PCR，锅柄PCR）（7）基因组序列比较研究（8）在临床医学和法医学中的应用（9）考古研究PrinciplesofGeneEngineering美国黄石国家公园的温泉thehotspringsinYellowstoneNationalParkPrinciplesofGeneEngineeringPrinciplesofGeneEngineeringPCR还可以用于考古1991年在Alp发现的目前最古老的木乃伊(Otzi)，5200岁。ThroughthePCRtechnique,thisDNAwascopiedor"amplified"sufficientlytoallowscientiststolearnsomethingabouthisgeneticmakeup.PrinciplesofGeneEngineering5.4其他分离目的基因的方法人们针对一些基因的特殊性，还设计了许多独特的方法来分离不同的基因。如染色体步行（walking）、染色体着陆（landing）、基因定位、基因表达文库的建立等等。PrinciplesofGeneEngineering

6外源基因导入宿主细胞6.1外源基因与载体的连接

6.1.1粘性末端DNA分子之间的连接

6.1.2平端DNA分子之间的连接

6.1.3粘平末端DNA分子之间的连接

6.1.4影响基因与载体之间连接的因素6.2重组分子导入宿主细胞

6.2.1重组分子导入大肠杆菌

6.2.2重组分子导入酵母细胞

6.2.3重组分子导入哺乳动物细胞PrinciplesofGeneEngineering6.1外源基因与载体的连接经过内切酶作用的目的基因和载体DNA，在连接酶的催化下，两个双链的DNA片段相邻的5‘端磷酸与3’端的羟基之间形成磷酸二酯键的过程，叫做连接（ligation）,连接的结果是外源基因与载体分子连接成为一个新的杂交分子，叫做“重组子”，这个过程也叫做“DNA分子的体外重组”。DNA分子之间的连接可以分为几种类型：（1）两个末端均为粘性末端（2）两个末端均为平端（3）一个末端为平端，一个末端为粘端PrinciplesofGeneEngineering6.1.1粘性末端DNA分子之间的连接两个末端为同一内切酶所切割形成：连接较为简单，但是载体自身连接问题严重，转化后长出的菌落中，由载体自身形成的连接占多数。可以通过将5'端的磷酸基团去磷酸化而解决。但是外源基因插入载体的方向有两种可能性。PrinciplesofGeneEngineering两个末端为不同的内切酶所切割形成：这时载体自身无法连接，转化后形成的重组子中载体自连极少，并且外源基因插入载体的方向可以确定，又叫定向克隆法PrinciplesofGeneEngineering6.1.2平端DNA分子之间的连接可以直接使用噬菌体的T4连接酶进行连接，但是效率比较低，同时也存在载体自身环化、基因插入载体的方向无法确定等问题。使用各种方法将平端改造为粘性末端进行连接，常用的方法有:同聚物加尾法衔接物连接法接头连接法等。平端的连接PrinciplesofGeneEngineeringPrinciplesofGeneEngineering在载体和目的基因两端分别加上能够相互配对的同一碱基聚合的单链的重组过程。由末端脱氧核苷酸转移酶进行，加在DNA的3'端的羟基上，长度可以达100个碱基左右，一般为20个碱基左右就可以了。同聚物加尾法PrinciplesofGeneEngineering衔接物（linker）是指使用人工合成的长度为10-20个碱基，并具有一个或几个限制性内切酶识别位点的平头末端双链寡核苷酸片段。人工接头法就是指先将衔接物与平头的目的基因连接，再使用衔接物中的内切酶切割，产生具有粘性末端的目的基因，再插到有粘性末端的载体中。衔接物连接法（人工接头法）PrinciplesofGeneEngineering衔接物连接法（人工接头法）PrinciplesofGeneEngineering单衔接物法：目的基因的两端使用的是同一种衔接物，仍然会引起载体自身环化和基因不能定向插入的问题。双衔接物法：基因两端使用不同的衔接物，酶切后产生不同的粘性末端。PrinciplesofGeneEngineering接头（adaptor）是由华人科学家吴瑞1978年发明的。是一种人工合成的，一端为某种限制性内切酶切点，另一端为平端的特殊双寡核苷酸片段。它的平端与目的基因的平端连接之后会使目的基因具有了粘性末端，这样与载体之间的连接易于进行。实际操作时，将接头粘性末端的5'端去磷酸化，使得自身无法环化。待平端部分与目的基因连接后，再使用激酶将5’端磷酸化进行连接。接头连接法PrinciplesofGeneEngineering1981年中美生物化学与分子生物学联合招生项目（China-UnitedStatesBiochemistryandMolecularBiologyExaminationandApplicationProgram，简称CUSBEA项目），PrinciplesofGeneEngineeringPrinciplesofGeneEngineering6.1.3粘平末端DNA分子之间的连接一个末端为平端，一个末端为粘端片段之间的连接,可以直接连接，或者将平端改造为粘端再连接。PrinciplesofGeneEngineering6.2重组分子导入宿主细胞受体细胞又叫“宿主细胞”，原核的宿主细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等；真核宿主细胞包括酵母、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞（包含组织培养细胞、胚胎干细胞、个体等等）。PrinciplesofGeneEngineering受体细胞一般不是天然的基因型，为了适合操作，一般均进行了改造，如大肠杆菌是限制性内切酶缺陷型，DNA重组缺陷型等；同时为了便于重组子的筛选，受体细胞往往是某一种基因功能缺陷型的；此外，为了基因工程的安全，宿主细胞不能具有感染性。同时宿主细胞应该易于生长，便于筛选。对于有害基因的克隆，宿主细胞有更高的要求。PrinciplesofGeneEngineering1970年，Mandel和Higa将大肠杆菌置于冰冷的CaCl2溶液中，然后瞬间加热，外源的噬菌体DNA即高效的转染大肠杆菌。这种方法广泛使用于大肠杆菌的转化，已经有许多改进。但是机理还不是完全清楚。外源DNA导入宿主细胞，改变细胞遗传性状的叫转化（transformation）;将病毒DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞叫“转染（transfection）,”与病毒的“感染（infection）”相区别。（1）氯化钙转化法PrinciplesofGeneEngineering采用脉冲高压瞬间击穿细胞膜使外源DNA高效进入细胞。适用对象十分广泛，动植物细胞、细菌、真菌、藻类等均可。仪器较贵，但是效率高，比较常用。（2）电穿孔法（电击法）PrinciplesofGeneEngineering使用Ca2+沉淀磷酸离子和DNA，沉积在细胞膜上的DNA被细胞吸收。可能是通过吞噬作用。用于动物细胞的转化。成本低，操作方便，但是效率也低。（3）磷酸钙共沉淀法PrinciplesofGeneEngineering利用类脂经过超声波、机械搅拌等可以形成双脂层小囊泡，将DNA包裹其中，它通过与细胞膜的融合而使DNA进入细胞。（4）脂质体（liposome）PrinciplesofGeneEngineering对于较大的哺乳动物的受精卵，可以在显微镜下操作，用极细的玻璃注射针头直接插入细胞内将DNA溶液注射到细胞内。效率极高，但是仪器昂贵操作复杂，技术不易掌握。（5）显微注射法显微注射法PrinciplesofGeneEngineering俗称基因枪法，使用直径为1um的惰性重金属（钨或金）粉末作为微弹，将DNA与粉末混合，使用高压气体发射弹头，微弹高速射入细胞。这种方法效率很高。常用于植物基因工程中的转化。在动物中也可以使用。（6）高速微弹发射装置法PrinciplesofGeneEngineering7重组体的鉴定和分析外源基因转化宿主细胞后，会形成庞大的宿主细胞群体，如何从这些细胞中分离到含有重组子的细胞使一个重要而繁杂的事情，特别是从基因文库中筛选尤甚。现在虽然设计出许多巧妙的方法，但是总的说来，重组子的筛选还是一件工作量比较大的事情。筛选含有重组子的细胞一般基于载体的特征或目的基因的序列特征或产物特征PrinciplesofGeneEngineering一般载体都有可筛选的遗传标记，最常用的是抗药性筛选标记、营养标记和显色标记，对于噬菌体来说，噬菌斑的形成是自我选择的结果。7.1载体特征的筛选PrinciplesofGeneEngineering常使用的是氨苄青霉素抗性标记（ampr）、氯霉素抗性标记（chlr）、四环素抗性标记（tetr）等。将细胞培养在含有这种抗生素的培养基中就可以进行筛选。将外源基因插入抗性基因编码序列内，可以通过插入失活的方式筛选。抗药性标记：PrinciplesofGeneEngineering营养选择标记：细胞生物合成途径中某个酶编码的基因失活，就可以称为营养缺陷型，但是如果导入细胞的重组子DNA可以弥补缺陷的基因，培养基中就可以无须加入有关的营养成分。PrinciplesofGeneEngineeringβ-半乳糖苷酶显色反应筛选法：当载体的lacZ区插入外基因后就丧失了编码α-肽的能力，带有外源基因插入的菌落呈白色，不带有外源基因的菌落成兰色，非常便于重组子的筛选。PrinciplesofGeneEngineering载体基因中含有大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因LacZ’的启动子和编码的部分(N端部分)α肽链的基因(统称LacZ’基因),在LacZ’基因中靠近5‘端有一个多克隆位点(如果有外源基因插入多克隆位点就会导致LacZ’基因的失活),另外还有一个调节LacZ基因活性的基因LacI.这种质粒的宿主细胞是一种β-半乳糖苷酶基因缺陷型,只能编码基因的C端一部分.当这种质粒生长在这种缺陷型细菌中时,在一定条件下能发生“互补”,使细胞具有正常的β-半乳糖苷酶活性。PrinciplesofGeneEngineering在利用LacZ基因来筛选重组子时,在细菌的培养基中加入LacZ基因启动子的诱导物---IPTG,当没有外源基因插入载体中的多克隆位点时,LacZ基因可以转录翻译,质粒和细菌β-半乳糖苷酶发生互补而具有活性,将同时加入的底物X-gal分解产生兰色菌落.如果有外源基因插入载体,则LacZ基因不能正常转录翻译,互补就不能发生,菌落呈白色。重组子的蓝白斑筛选PrinciplesofGeneEngineeringPrinciplesofGeneEngineering

7.2利用目的基因特征进行筛选细菌菌落或噬菌斑的原位杂交利用序列相同或相近的DNA序列一定条件下可以退火，形成杂种分子的原理，使用一段与目的基因相同或近似的DNA做为“探针（probe）”，与筛选对象中含有的DNA杂交，然后再检测杂种分子，进而发现含有目的基因（或片段）的重组细胞。PrinciplesofGeneEngineering平板上待筛选的细胞群体通过特制的工具将菌落转移到膜