第九章酶的非水相催化课件

EnzymaticcatalysisinNon-aqueoussystem

酶在非水介质中进行的催化作用称为酶非水相催化第六章酶的非水相催化

有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。6.1.1有机介质中的酶催化6.1.2气相介质中的酶催化

酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。6.1.3超临界流体介质中的酶催化

酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。6.1.4离子液介质中的酶催化

在离子液中进行的催化作用。离子液（ionicliquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的，在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。6.2有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响6.2.1有机介质反应体系（1）微水介质体系(含水量一般小于2%)酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机溶剂中，在悬浮状态下进行反应。（4）胶束体系（5）反胶束体系反相胶束与生物膜有相似之处适用于生物膜表面或与膜结合的酶的结构、催化特性和动力学性质研究。（酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束）看图正、反胶束体系“钢性”与”柔性”的动态平衡（维持酶催化活性）“紧密”：酶分子内的氢键“开启”：酶分子间的氢键a．不同酶需水量不同b.同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同溶剂疏水性越强，需水量越少刚性：生物大分子结构的精确性柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。6.2.2水对有机介质中酶催化的影响生物催化剂必需水层（1）必需水（essentialwater）：

紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。（1）与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）：一个酶分子周围有0-60个水分子，蛋白质自由度无，酶活无（2）与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)：一个酶分子周围有60-220个水分子，蛋白质自由度上升，显示出酶活（3）凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.25~0.38g/g）：一个酶分子周围有220-300个水分子，蛋白质自由度上升，最大酶活（4）酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。：酶分子周围的水分子达到300以上，酶活降低，自由度最大干燥的酶水合过程：有机溶剂的极性lgP——极性参数P：溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数

研究表明，有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子结合水，对酶活力的影响就越大。用有机溶剂极性参数lgP描述有机溶剂的极性与酶活力之间的关系溶剂极性对酶活性影响的规律（Laane规律）lgP性质水中溶解度/%(20℃)对酶活性的影响≤2

极性溶剂＞0.4容易使酶失活，较少使用＞2，＜4中等极性0.04～0.4酶的活性难以预测，小心使用。可以表现酶活≥4非极性＜0.04不会引起酶的变性，能保持酶的高活性（1）有机溶剂对酶必需水的影响极性弱的溶剂：影响小极性强的溶剂：夺取酶必需水疏水性溶剂：不易溶解吸附酶必需水酶的失水与溶剂的极性参数（lgP）和介电常数（ε）相关，与系统中底物的极性、底物浓度和含水量均有关系催化过程：S→E-S→E-P→P（水相反应）S→watershell→E-S→E-P→P→organicphase（非水介质）主要推动力：底物-酶之间的结合能OrganicSolventE-SE-P底物分子必须先进入酶分子的必需水层，再进入到酶活性中心完成催化过程，产物同样需要先进入水层再转移到反应介质。（2）有机溶剂对底物和产物分配的影响+底物与有机介质的极性差异N—Ac—L—PheOEtN—Ac—L—SerOEt疏水性底物亲水性底物叔丁醇或叔丁胺亲水性溶剂CH2Cl2疏水性溶剂subtilisin

反应快反应快许多酶活性中心是疏水性的，容易与疏水性底物结合进行反应，疏水性底物容易从水中析出到达疏水性活性中心。在疏水性强的有机溶剂中，疏水性底物与有机溶剂间的相互作用增强，底物从溶剂中到达活性中心比在水中困难，从而酶催化反应速度减慢。极性小疏水性强底物在有机溶剂中溶解度大难于进入必需水层极性大亲水性强底物在有机溶剂中溶解度小，底物浓度降低有机溶剂催化速度降低适宜lgP：２≤

lgP≤5（疏水性底物）有机溶剂对酶催化反应的影响：酶的活性和稳定性酶的底物特异性、对映体选择性、潜手性选择性、位置选择性、化学键选择性原因：与必需水作用与底物和产物作用改变酶蛋白的结构与柔韧性改变酶促反应动力学特征有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用:一是有机溶剂与酶直接发生作用通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象从而导致酶的活性被抑制或酶的失活;二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响正常反应的进行;三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用6.3有机溶剂对有机介质中酶催化的影响6.4酶在有机介质中的催化特性有机介质对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性.底物特异性立体选择性区域选择性键选择性热稳定性活性pH值6.4.2立体选择性

酶的立体选择性（enantioselectivity）又称为对映体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。实验表明：疏水性越强的溶剂，酶的立体选择性越6.4.3位置选择性酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。位置特异性：酶可以选择性地催化底物中某个区域的基团发生反应就是位置特异性，也称区域选择性。6.4.4化学键选择性化学键选择性是指当同一个底物分子中有2个以上的化学键都可以与其进行反应时，酶对其中的一个化学键可以优先进行催化反应。介质的转换对酶的化学键选择性有不同程度的影响（2）分子记忆根据分子识别理论，酶通过配体的诱导、相互作用改变酶的构象，从而获得与配体类似物结合的能力，这种由配体诱导产生的酶的记忆的方法称为分子记忆（molecularmemory）酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功能。有机相生物印迹酶

枯草杆菌蛋白酶溶液

含N-Ac-Tyr-NH2

冻干除去抑制剂枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶溶液

不含N-Ac-Tyr-NH2

冻干枯草杆菌蛋白酶在辛烷中催化酯化反应的速度比较：反应（1）中得到的酶比反应（2）中得到的酶高100倍在水溶液中其活性：相同掌握原理（1）（2）＋酶蛋白抑制剂冻干除去抑制剂有机溶剂水溶液枯草杆菌蛋白酶的分子记忆原理：竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。水直接或间接参与了酶天然构象中所有的非共价相互作用,水充当了酶结构的“润滑剂”，使酶分子的柔性增强，原来形成的高活性构象不再保持。（2）pH记忆和离子强度在水溶液中：pH决定酶的离子化状态，从而影响酶的构象，而酶的构象又关系到酶的活性和选择性；在有机溶剂中酶不能电离，因此必须进行预处理：将酶先溶解在少量最适pH值的缓冲溶液中，然后沉淀或冻干。这样可以保持酶的最佳电离状态，其活性与干燥前所处的缓冲液pH和离子密切相关，最适pH与水相中的最适pH相同。有机相中酶能够记住最后保存其的水溶液的pH，称为“pH记忆”（pHmemory）。从最适pH值水溶液中沉淀的酶在有机溶剂介质中也表现出较高的酶活性，有时可提高一个数量级。沉淀或冻干最适pH水或缓冲液有机溶剂pH决定酶的离子化状态→影响酶的构象→酶的活性和选择性可以保持酶的最佳电离状态，“记住”最适pH最适pH与水相中的最适pH相同。有机相中酶能够记住最后保存其的水溶液的pH，称为“pH记忆”（pHmemory）。“pH记忆”原因（A）有机溶剂不会改变酶蛋白带电基团的离子化状态，（在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象)。所以酶在有机溶剂中的化学状态与从中提取该酶的水溶液中的化学状态保持相同；（B）酶在有机溶剂中结构刚性的增加保持了之前水溶液中带电官能团正确的离子化状态，对酶的活性和稳定性都非常重要。实验现象：随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大，酶活会增大。6.6酶非水相催化的应用

酶催化反应应用脂肪酶肽合成青霉素G前体肽合成酯合成醇与有机酸合成酯类转酯各种酯类生产聚合二酯的选择性聚合酰基化甘醇的酰基化蛋白酶肽合成合成多肽酰基化糖类酰基化羟基化酶氧化甾体转化过氧化物酶聚合酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物的羟基化胆固醇氧化酶氧化胆固醇测定醇脱氢酶酯化有机硅醇的酯化应用：6.6.1.手性药物的拆分

手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物

手性药物一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效一种有显著疗效，另一种有毒副作用两种对映体的药效相反两种对映体具有各自不同的药效两种消旋体的作用具有互补性手性药物两种对映体的药效差异手性药物的拆分方法分为：非生物法、生物法非生物法（机械分离法、形成和分离对映体异构法、色谱分离法、动力学拆分）生物拆分法原理实质即两个对映体竞争酶的同一个活性中心位置，两者的反应速率不同，产生选择性，从而使反应产物具有光学活性。手性药物两种对映体的药理作用

药物名称有效对映体的作用另一种对映体的作用普萘洛尔萘普生青霉素胺羟基苯哌嗪反应停酮基布洛芬喘速宁乙胺丁醇萘必洛尔S构型，治疗心脏病,β-受体阻断剂S构型，消炎、解热、镇痛S构型，抗关节炎S构型，镇咳S构型，镇静剂S构型，消炎S构型，扩张支气管S构型，抗结核病右旋体，治疗高血压,β-受体阻断剂R构型，钠通道阻滞剂R构型，疗效很弱R构型，突变剂R构型，有神经毒性R构型，致畸胎R构型，防治牙周病R构型，抑制血小板凝集R,R构型，致失明左旋体，舒张血管Shu-LaiLiu，DongzhiWei*,etal.,BioprocessandBiosystemsEngineering,2006(Inpress).Shu-LaiLiu，DongzhiWei*,etal.,PreparativeBiochemistry&