阪崎肠杆菌检验-课件

阪崎肠杆菌检验

GB4789.40--2010

Enterobactersakazakii(ES)2内容第一部分：一般特征第二部分：致病性第三部分：ES的检验3阪崎肠杆菌(E．sakazakii)是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种，在一定条件下可引起人和动物致病。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50%以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。第一部分：一般特征培养特征生化反应抵抗力增殖能力与其他常见肠杆菌相似5一、培养特征阪崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、血平板、麦康凯(MacConkey，MAC)琼脂、伊红美蓝琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。ES在VRBGA平板上首次划线分离时，37℃培养24h可生成2种不同的形态学特征：干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。

6本实验室大多数分离株呈流蜡样，粉紫色、圆形、光滑、凸起、饱满，并散发出特殊气味；干燥、顶端发白的粉紫色菌落；从配方粉中初次分离到的该菌在VRBGA平板上过夜培养后呈现特殊的菌落形态：菌落干燥、边缘有褶皱，极富弹性。传代后，菌落皱褶减少，延长培养时间，可见皱褶逐渐增加。7二、生化反应

8DNASE-脱氧核糖核酸酶10注：＋：90-100％；(＋)：75-89%；V：25-74％；(－)：10-24％；－：0-9％三、抵抗力耐热性渗透压干燥不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消毒过程能有效的灭活ES。

ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株，增加PIF（婴儿配方奶）加工后污染的危险性，使其在PIF（婴儿配方奶）

中长期存活。11四、增殖能力

6℃，21℃，37℃分别是13.7h，1.7h，19－21min研究发现，与本底相比，25℃放置6h该菌的相对危险性可增加30倍；25℃放置10h可增加30000倍。2004年2月FAO/WHO在日内瓦召开的PIF中ES专家研讨会上提出PIF中微量的ES（＜3CFU/100g）污染也能导致感染的发生。12第二部分：致病性易感人群主要感染渠道配方粉中ES的污染状况PIF中ES的来源及中毒发生的原因13一、易感人群婴儿：脑膜炎坏死性小肠结肠炎菌血症严重的神经系统后遗症高危人群：主要是婴儿，新生儿、尤其是早产儿、低出生体重等免疫力低下的婴儿。死亡率：50%，20-50%成人：局部感染、菌血症、术后骨髓炎等14二、主要感染渠道！！！乳品安全标准（报批稿）《婴儿配方食品》《特殊医学用途配方食品》0-6个月龄15第三部分

食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验本标准修改采用ISO/TS22964（1stedition2006-02-01）Milkandmilkproducts—DetectionofEnterobactersakazakiiFDAJuly2002;RevisedAugust2002IsolationandEnumerationofEnterobactersakazakiifromDehydratedPowderedInfantFormula17第一法：阪崎肠杆菌的检验

第二法：阪崎肠杆菌的计数

18第一法

阪崎肠杆菌的检验19阪崎肠杆菌检验程序报告生化鉴定挑取黄色菌落DFI琼脂36℃±1℃，24h±2h挑取蓝绿色菌落1mL+mLST-Vm10mL44℃±0.5℃，24h±2h检样100g/mL+BPW稀释液900mL36℃±1℃，18h±2h前增菌选择性增菌选择性分离生化鉴定TSA25℃±1℃，48h±4h5.1前增菌和增菌BPW（合适时可选择无菌水）左图：未混合；右图：混合后。21mLST-VmmLST-Vm，即在大肠菌群增菌肉汤LST中另加入适量的NaCl和Vm。研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希氏菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能力。加入0.5M的NaCl在保证ES良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。Vm可有效地抑制G+菌的生长。而较高的生长温度可以进一步抑制其他细菌的生长。225.2分离显色培养基的基本原理相似，二者都是根据ES能产生α-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc产生有色菌落。23显色培养基对ES的选择性较好，ES形成的特征性菌落易于辨认，以DFI为例：硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量α-葡萄糖苷酶但H2S阳性菌株（如普通变形杆菌）。ES都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落其他常见菌在DFI平板的菌落颜色白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌属的多种菌等黄色菌落：赫氏埃希氏菌黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种ESIA:蓝色，1-3mm国产显色培养基2426TSA：25℃培养后典型ES：黄色阴性对照E.coliATCC25922：白色菌落27黄色素5.3鉴定（生化反应）29商业生化鉴定系统的应用推荐使用的ES生化鉴定方法有很多，主要有API20E，ID32E，BiologGN2MicroPlate，VITEKGNI+等。上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API20E和VitekGNI+。30API20E生化鉴定板典型生化反应图示31第二法

阪崎肠杆菌的计数323管MPN法337.1样品的稀释7.1.1固体和半固体样品：无菌称取样品100g、10g、1g各三份，加入已预热至44℃分别盛有900mL、90mL、9mLBPW中，轻轻振摇使充分溶解，制成1:10样品匀液，置36℃±1℃培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。7.1.2液体样品：以无菌吸管分别取样品100mL、10mL、1mL各三份，加入已预热至44℃分别盛有900mL、90mL、9mLBPW中，轻轻振摇使充分混匀，制成1:10样品匀液，置36℃±1℃培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。7.2分离、鉴定:同5.2，5.3。8结果与报告综合菌落形态、生化特征，根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数，查MPN检索表，报告每100g（mL）样品中阪崎肠杆菌的MPN值（见附录Ｂ中表B.1