液相色谱基础

液相色谱基础第1页，课件共36页，创作于2023年2月我们实验室的HPLC第2页，课件共36页，创作于2023年2月碳酸钙（固定相）色素混合液石油醚(流动相）1906年，俄国植物学家Tsweet

发现植物色素分离现象

色谱柱色带一、色谱起源第3页，课件共36页，创作于2023年2月液相色谱基础知识定义：色谱法是一种重要的分离分析方法，它是利用不同物质在两相中具有不同的分配系数(或吸附系数、渗透性)，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复分配而实现分离。固定相可以装在柱内，也可以做成薄层。前者叫柱色谱，后者叫薄层色谱。第4页，课件共36页，创作于2023年2月液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用

气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力

液相色谱基础知识第5页，课件共36页，创作于2023年2月液相色谱基础知识反相液相色谱

流动相极性大于固定相极性能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物正相液相色谱

流动相极性小于固定相极性不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC第6页，课件共36页，创作于2023年2月液相色谱基础知识采用“HPLC”

级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相的选择第7页，课件共36页，创作于2023年2月溶剂等级水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率第8页，课件共36页，创作于2023年2月水/甲醇梯度ODS柱鬼峰GradientCurve1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.溶剂等级鬼峰的出现第9页，课件共36页，创作于2023年2月溶剂等级溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱第10页，课件共36页，创作于2023年2月甲醇乙睛正己烷分析纯级(实线）和HPLC级溶剂（虚线）

的吸光度比较溶剂等级第11页，课件共36页，创作于2023年2月GeneralMaintenanceandTroubleshooting缓冲液的使用使用前必须过滤使用后一定要对柱子进行清洗，以免造成腐蚀、磨损及阻塞:首先用纯水冲洗10-30min(0.5-1ml/min)，再用甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min)易受到细菌和霉菌的影响

溶剂等级注意冲洗次序，不能直接用有机溶剂冲洗

第12页，课件共36页，创作于2023年2月过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小物理颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是在使用无机盐配制的缓冲液的时候必须过滤脱气：除去在流动相中溶解或彼此混合而产生的气泡

气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动无在线脱气应注意：1）每天脱气2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长溶剂前处理第13页，课件共36页，创作于2023年2月液相色谱基础知识

梯度洗脱形式：线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系折线梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈跳跃关系梯度洗脱装置：高压梯度：高压泵将不同的流动相增压后送入梯度混合室混合,然后再送入色谱柱的方法。低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。第14页，课件共36页，创作于2023年2月梯度洗脱形式的选择第15页，课件共36页，创作于2023年2月液相色谱基础知识梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度，提高检测器的灵敏度注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）第16页，课件共36页，创作于2023年2月使用适宜的流动相溶解样品在溶剂选择的时候，应注意以下原则：--减少溶剂峰，尤其是不可使用组分峰靠近溶剂峰的流动相--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在色谱柱中产生沉淀

2.进样前一定使用0.45um的膜进行过滤如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤样品处理第17页，课件共36页，创作于2023年2月进样器自动进样器（SIL-10A/SIL-10Ai/SIL-10ADvp）手动进样器原理：（六通阀）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入液相色谱基础知识第18页，课件共36页，创作于2023年2月手动进样器的原理图

装填状态液相色谱基础知识进样状态第19页，课件共36页，创作于2023年2月交叉污染的原因微量注射器红色表示残留样品第20页，课件共36页，创作于2023年2月手动进样法

普通方法

1.在进样状态下清洗针口

2.在装填状态下插入微量注射器

3.注入样品

4.切到进样状态第21页，课件共36页，创作于2023年2月手动进样法便捷方法

1.进样状态下插入微量注射器

2.切到装填状态

3.注入样品

4.切回到进样状态第22页，课件共36页，创作于2023年2月柱温箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性液相色谱基础知识第23页，课件共36页，创作于2023年2月柱压低于150kgf/cm2柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃缓冲液PH使用范围为2～7ODS柱的使用注意点：硅胶在PH为3～4时稳定性最好碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。液相色谱基础知识第24页，课件共36页，创作于2023年2月液相色谱基础知识色谱柱的类型及适用范围硅胶基底聚合物基底pH范围2-7宽范围有机溶剂所有有限制压力〈150kgf/cm2低压温度宽范围〈60℃第25页，课件共36页，创作于2023年2月分析柱的维护在使用新柱之前，最好用强溶剂如甲醇在低流量下(0.2-0.3ml/min)冲洗30min，长时间未用的分析柱也要同样处理定期使用强溶剂冲洗柱子3、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗4、净化样品5、分离条件6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯第26页，课件共36页，创作于2023年2月常用检测器紫外检测器（包括二极管阵列检测器）荧光检测器示差折光检测器电导检测器蒸发激光散射检测器液相色谱基础知识第27页，课件共36页，创作于2023年2月原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：比耳定律，A＝KCL优点：1）灵敏度高

2）对温度和流速不敏感

3）可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外检测器第28页，课件共36页，创作于2023年2月二极管阵列检测器第29页，课件共36页，创作于2023年2月二极管阵列检测器（SPD－M10AVP）--二十一世纪标准紫外检测器色谱定性依据：保留时间常规紫外检测器峰纯度二极管阵列检测器液相色谱基础知识第30页，课件共36页，创作于2023年2月

样品池二极管阵列光栅D2/W灯每一组分可在每一波长处得到一吸光度值二极管阵列检测器第31页，课件共36页，创作于2023年2月1）采集三维谱图2）峰纯度检验3）光谱库检索4）可以发现单波长检测时未测到的峰二极管阵列检测器的优点第32页，课件共36页，创作于2023年2月原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测优点：1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一2）选择性好3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）荧光检测器第33页，课件共36页，创作于2023年2月原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。优点：通用型检测器缺点：1）对温度变化敏感2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度洗脱3）属于中等灵敏度的检测器示差折光检测器第34页，课件共36页，创作于2023年2月液相色谱基础知识

蒸发激光散射检测器

原理:色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速氮气喷成雾状液滴，溶质形成不挥发的微小颗粒，被载气带到检测系统。进入散射室中，检验散射光的强度。优点:消除了溶剂干扰以及