第9章+真核生物基因表达的调控教学课件

原核生物真核生物基因组小基因组大,人类基因组全长3×109bp编码3万个基因,其余为重复序列等

基因分布在同一染色体上，操纵子控制。DNA与组蛋白结合成核小体,核小体的状态及其超螺旋结构影响基因表达;以正调控为主，有多个调控序列，须有多个激活物同时作用调节基因转录转录和翻译同时进行,大部分为转录水平调控。转录和翻译在时间和空间上均不同，从DNA到蛋白质的各层次上都有调控，但多数为转录水平调控操纵子调控单细胞

多样化调控，更为复杂。多为多细胞，受环境影响小真核生物与原核生物的调控差异正负调控同等重要7/23/20231基因组结构低等生物高等真核生物7/23/20232核小体结构如图所示:7/23/202337/23/20234DNA水平基因丢失基因扩增基因重排甲基化修饰染色质的结构状态RNA水平转录水平调控RNA的转录后加工mRNA转运mRNA稳定性蛋白质水平翻译过程翻译后加工蛋白质的稳定性真核生物基因表达的调控：7/23/202351、基因丢失一、染色体水平的调控马蛔虫（Parascarisequoorum）（2n=2）7/23/202367/23/20237非洲爪蟾的染色体上有约450拷贝编码18SrRNA和28SrRNA的DNA，在卵母细胞中它们的拷贝数扩大了1000倍.一旦卵母细胞成熟，多余的rDNA就没有用了，将被逐渐降解。2、基因扩增（amplification）

基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。多线染色体（polytennechromosomes）DNA可以特异扩增上千倍，而在异染区附近只可复制几次。7/23/20238基因组序列的选择性扩增1.dhfr基因氨甲喋呤（methotrexate）二氢叶酸还原酶(DHFR)均染色区（homogeneouslystainingregion,HSR）双微体(double-minutechromosomes)7/23/20239均染色区（homogeneouslystainingregion,HSR）

7/23/202310双微体(double-minutechromosomes)

7/23/2023117/23/2023127/23/2023133、基因重排（rearrangement）将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因的表达以及酵母的接合型转变.7/23/202314免疫球蛋白的重排抗体有100万种以上，一种淋巴细胞只产生一种抗体1.指令学说：上世纪40年代由Pauling提出2.克隆选择学说：1957年Burnet提出3.体细胞重组学说：上世纪60年代提出，1976年由利根川进（日本）证实。7/23/202315产生抗体B细胞体液免疫经法氏囊(BarsaofFabricius)细胞分裂骨髓经胸腺调节免疫应答T细胞细胞免疫杀伤抗原7/23/202316免疫球蛋白的肽链主要由可变区（V区）、恒定区（C区）以及两者之间的连接区（J区）组成7/23/2023177/23/2023187/23/2023197/23/202320二、染色质水平的调控在细胞核内基因组DNA以核小体（nucleosome）为基本单位形成染色质（chromatin）。核小体在DNA上的组装是一个干扰DNA复制、基因表达和细胞周期进展的过程。7/23/2023211、染色质的状态阻遏状态：DNA被压缩在细胞核中，基因处于非活性状态，组蛋白为染色质活性的阻遏蛋白；活性状态：具有活性潜能的基因失去H1，处于染色质的伸展状态；激活状态：顺式调控元件中结合了基础转录因子及激活因子等，活性染色质处于松弛状态。7/23/202322真核基因的活跃转录是在常染色质上进行的。转录发生之前，染色质常常会在特定的区域被解旋松弛，形成自由DNA。这种变化可能包括核小体结构的消除或改变，DNA本身局部结构的变化等，这些变化可导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA的结合，诱发基因转录。活性的染色质7/23/202323异染色质结构致密，处于阻遏状态

组成型异染色质：在各种细胞中都处于凝聚状态，如着丝粒、端粒等，不能转录，不含基因。

兼性异染色质：在某种发育阶段或生理条件下由常染色质变成异染色质（异染色质化），如哺乳动物X染色体常染色质结构疏松，是进行活跃转录的部位。2、异染色质化：7/23/202324染色质的占先模型提出：如在启动子上已形成了核小体，那么转录因子和RNA聚合酶是不能和启动子结合的；如转录因子和RNA聚合酶在启动子上已建立了稳定的起始复合体，那么组蛋白将被排除在外。3、组蛋白对基因活性的影响7/23/202325组蛋白对5SrRNA基因转录的影响如：爪蟾有两类5SrRNA基因，一类只出现在卵母细胞中（卵母细胞型5SrRNA），另一类在卵母细胞和体细胞中都被转录（细胞型5SrRNA）。Why？纯DNA的体外转录：两者都转录；染色质的体外转录：卵母细胞中卵母细胞型5srRNA基因有活性，但体细胞无7/23/202326组蛋白的乙酰化和去乙酰化组蛋白的乙酰化和基因表达的状态相关。高乙酰化是活性染色质的标志之一，低乙酰化常伴随着转录沉默。HATs(histoneacetytransferases)组蛋白乙酰化酶HDACs(histonedeacetylases)HATs有两组，一组为A组，和转录有关；另一组是B组，和核小体装配有关。7/23/202327乙酰化促进基因转录组蛋白H4的去乙酰化是雌性哺乳动物一条X染色体失活的原因之一。组蛋白乙酰化与转录起始复合体的装配乙酰化导致组蛋白正电荷减少，削弱了它与DNA的结合能力，使核小体解聚；阻止了核小体装配，使染色质处于松弛状态；组蛋白去乙酰化与基因沉默组蛋白去乙酰化可导致基因转录受抑制7/23/202328辅激活因子可能有HAT乙酰化核小体组蛋白尾巴的活性7/23/202329用DNA酶I处理各种组织的染色质时，发现处于活性状态的基因比非活性状态的DNA更容易被DNA酶I所降解。鸡成红细胞（erythroblast）染色质中，β-血红蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被DNA酶I切割降解。鸡输卵管细胞的染色质中被DNA酶I优先降解的是卵清蛋白基因，而不是β-血红蛋白基因。活性染色质的DNAase高敏感性7/23/202330一般在转录起始点附近，即5′端启动子区域，少部分位于其它部位如转录单元的下游。超敏感位点的存在是活性染色质的重要特征，与基因的表达有密切关系超敏感位点（hypersensitivesite)：含有转录活性基因周围对DNaseⅠ高度敏感的区域。7/23/2023314、核基质与基因活性染色体DNA通过长约200bp富含AT的基质附着区（matrixattachmentregion，MAR）结合于核基质（nuclearmatrix，也称骨架蛋白）。核基质可为DNA复制提供结构支架，参与RNA的转录和加工DNA与核基质的结合具有特异性。如卵蛋白基因与小鸡卵巢细胞的核基质结合，而不与肝脏或红细胞的核基质结合。珠蛋白基因不与卵巢核基质结合，而与红细胞的核基质结合7/23/2023325.DNA甲基化与转录抑制m5C（5-甲基胞嘧啶)是真核生物DNA中的主要修饰成分多发生在CpG序列中5'-mCpG-3'3'-GpCm-5'全甲基化5'-mCpG-3'3'-GpC-5'半甲基化7/23/202333用同裂酶（isoschizomers）可检测CCGG上C的甲基化状态。MspI可切割CmCGG或CCGG，HpaII可切割未甲基化CCGGHpaII7/23/202334在一些不表达的基因中，启动区的甲基化程度很高，而处于活化状态的基因则甲基化程度较低。去甲基化又可使基因恢复活性。7/23/2023357/23/202336甲基化的转录抑制作用机制：

DNA甲基化直接干涉特异性转录因子与各自启动子内识别位点的结合。甲基化CpG结合蛋白（MeCP）与模板DNA结合，阻止转录。甲基化影响染色质的结构。稳定染色质的失活状态，阻止转录因子进入，防止染色质的活化7/23/202337◆DNA甲基化的生物学效应X染色体失活亲本印迹肿瘤发生个体发育CpG甲基化7/23/202338◆基因组印记(genomicimprinting)7/23/2023391956年A.Prader和H.Willi父源染色体15q11-13区段缺失,智力低下、过度肥胖、身材矮小、小手足

Prader-Willi综合征(PWS)Angelman综合征(AngelmanSyndrome，AS)1968年H.Angelman母源染色体15q11-13区段缺失。特殊容貌、大嘴、呆笑、红面颊、步态不稳、癫痫、严重智力低下

7/23/202340近年研究表明，基因组印迹是两个亲本等位基因的差异性甲基化造成了一个亲本等位基因的沉默，另一个亲本等位基因保持单等位基因活性7/23/202341印记:来源于父母本的一对等位基因表达不同。如源于父本的IGF-Ⅱ(胰岛素样生长因子Ⅱ)基因可表达，而源于母本的则不能表达。此是由于卵母细胞中的IGF-Ⅱ已被甲基化，而精子中的IGF-Ⅱ未被甲基化，所以这一对等位基因在合子中表现不同。7/23/202342亲本的IGF-Ⅱ等位基因在早期胚中被差异甲基化，在成体形成配子时仍保留原甲基化的模式。7/23/202343目前在人类和鼠身上已辨明了20种印迹基因。7/23/202344

雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保其与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。一旦发生X染色体失活，使该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条X染色体失活。◆DNA甲基化与X染色体失活失活X染色体特点组蛋白H4不被乙酰化CpG岛的高度甲基化7/23/202345抑癌基因甲基化不表达◆肿瘤发生7/23/2023467/23/202347三、真核生物转录水平的调节顺式作用元件（cis-actingelement）包括启动子、增强子和沉默子等反式作用元件（trans-actingelement）激活因子、阻遏因子等7/23/2023481、顺式作用元件（cis-actingelement）（1）启动子（promoter）RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。7/23/202349（2）增强子（enhancer）能使基因转录频率明显增加的DNA序列。7/23/202350增强子的作用原理7/23/202351（3）沉默子（Silencer）某些基因含有负性调节元件——沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。7/23/2023522、反式作用因子三个功能结构域：DNA结合结构域；转录激活结构域；调控因子的激活结构域（蛋白质与蛋白质结合）能识别并结合顺式作用元件(cis-actingelement)正调控与负调控反式作用因子

识别/结合顺式作用元件中的靶序列启动转录例：转录因子TFⅡD识别结合TATAbox

转录因子SP1识别结合GCbox

转录因子CTF1识别结合CCAATbox7/23/202353螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)锌指结构(zincfingermotif)亮氨酸拉链结构(leucinezipper)螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)碱性α螺旋(alkalineα-helix)

DNA结合域(DNA-bandingdomain)蛋白质因子识别和结合DNA元件所必需的结构域7/23/202354螺旋转角螺旋锌指结构亮氨酸拉链螺旋环螺旋同源异形结构域7/23/202355是最简单的结构基序之一，该结构域长约20个aa，主要是两个α-螺旋区和将其隔开的β转角。C端螺旋被称为识别螺旋区，可与DNA大沟中的碱基直接接触。另一端螺旋无特异性,与DNA骨架接触螺旋-转角-螺旋（Helix-turn-helix，HTH）7/23/202356锌指结构（zincfinger，ZF）一个蛋白质结构域，长约30个aa，其中4个氨基酸（4个Cys或2个Cys，2个His）与一个Zinc原子相结合，形成一个四面体结构。与Zinc结合后锌指结构较稳定。与DNA双螺旋大沟结合CysCysCysCysHisHisHisHis半胱氨酸7/23/202357123456789蛋白质7/23/2023587/23/202359螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）约由60aa组成，含有2个α螺旋，由长约9－20个氨基酸残基的连接区(环)相连，两个螺旋富含高度保守的疏水氨基酸残基。同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能，其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。二聚体7/23/202360一段肽链上每隔7个aa出现一个leu，借助于leu侧链的疏水相互作用而形成同向平行的拉链状，进而形成二聚体结构。由肽链氨基端20～30个富含赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）的结构域与DNA结合。亮氨酸拉链（leucinezipper，ZIP）7/23/202361蛋白质与蛋白质结合结构域一般由20－100aa残基组成据结构特点分为：酸性氨基酸聚集的结构域：负电荷高度集中，呈酸性；有一个两亲性螺旋，螺旋一侧富含酸性氨基酸，另一侧为疏水性残基富含谷氨酰胺的结构域：富含谷氨酰胺富含脯氨酸的结构域：7/23/202362蛋白质调节因子功能的鉴别方法蛋白质与DNA的结合能力

方法：电泳迁移后滞分析（EMSA）足迹法分析DNA上蛋白质结合位点7/23/202363电泳迁移后滞分析（EMSA）7/23/202364足迹法7/23/202365蛋白质－蛋白质互作的分析酵母双杂交试验7/23/2023667/23/2023677/23/202368四、基因转录后水平的调控1、不同剪接方式可产生不同的mRNA不同5′端的选择选择不同的3′端选择不同外显子按不同方式对mRNA前体进行的剪接。7/23/2023695′端的选择有的基因具有两个启动子区，每一区都有它自己的组织调控元件，那么两个长度不同的转录本将会产生组织特异性mRNA和蛋白产物。7/23/202370选择不同的3′端利用多个多聚（A）位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质7/23/202371选择不同外显子7/23/2023722、RNA干扰（RNAinference）RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指当细胞中导入与内源性mRNA同源的双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。7/23/202373RNAi于2019年被美国《Science》杂志评选为全球年度十大科学进展之首。7/23/202374美国科学家克拉格·米洛(47)

美国科学家安德鲁·费里(45)7/23/202375

RNA干扰的作用机制

长片段dsRNA在细胞内被Dicer酶切成长度大约为19-23nt的小片段干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，由siRNA参与构成复合物RISC(RNA-inducedsilencecomplex)。siRNA通过与同源mRNA的特异配对，引导RISC特异地降解同源mRNA，导致基因表达的抑制。因此小片段的siRNA也可以诱导高效的基因沉默。7/23/2023767/23/202377RNAi技术7/23/202378五、翻译水平的调节1、mRNA的稳定性

原核生物mRNA的半衰期很短，平均大约3min。高等真核生物